Спосіб одержання церулоплазміну

Изобретение.относится к медицинской промышленности и касается способа получения ферментного препарата церулоплазмина. Цель изобретения - устранение пирогенности и повышение степени очистки. Способ осуществляется гомогенизацией отходов производства гамма-глобулина фракции III по Кону в растворе хлористого натрия, сорбцией гомогената на ДЭАЭ-целлюлозе, злюцией 0,15-0,17 М раствором хлористого натрия, осаждением целевого продукта этанолом в конечной концентрации 65-75% об.%, растворением осадка в 0,25-0,26 М растворе хлористого натрия, центрифугированием, корректированием рН до 5,2-5,3 и доведением до 24-26°С, осаждением этиловым спиртом и хлороформом до конечной концентрации соответственно 24-26 и'2~4 об.%, перемешиванием 25-30 мин, центрифугированием образовавшегося осадка, доведением концентра-' ции этилового спирта до 45-55 об.%, выдерживанием в течение 12-18 ч при минус 10-15°С, осаждением осадка центрифугированием, растворением его, стерилизующей фильтрацией и лиофильным высушиванием. Препарат является апирогенным. 2 табл. Изобретение относится к технологии получения фермента крови человека - церулаппазмина и может быть использовано при производстве медицинских препаратов. 18 ч при 4°С, Целлюлозу с сорбированным церулоплазмином отмывают от несорбированных белков на нутч-фильтре 2000 л охлажденного до 3-4°С 0,08 М раствора натрия хлористо-го до величины оптической плотности жидкости на выходе при длине волны 280 нм (Е28о). равной 0,100. Отмытый от баластных белков сорбент переносят 8 хроматографическую колонку и производят десорбцию церулоплазмина охлажденным до 3-4°С 0,16 М хлористым натрием. По^ лученные 8 л элюата осаждают охлажденным до 0°С этиловым спиртом до конечной концентрации 65 об.% с последующим центрифугированием при 12 тыс. об/мин в течение 1 ч. Цель изобретения - устранение пирогенности и повышение степени очистки. П ри ме р 1. 26 кг осадка фракции III по Кону плацентарной сыворотки, хранившейся в течение І.ЕГмес, гомогенизируют в 130 л охлажденного до 4°С 0,05 М раствора натрия хлористого, измеряют рН гомогената и доводят его до рН 6,3. В полученную суспензию добавляют 3,5 кг ДЭАЭ-целлюлозы (бисерной, фирмы Реанал ВНР). Смесь оставляют при слабом перемешивании на 42-90 о со > 1607137 Осадок полуфабриката церулоплазмина в количестве 320 г растворяют в 1 л 0,24 М раствора натрия хлористого, полученный раствор просветляют центрифугированием 1 ч при 6 тыс. об/мин для удаления нерастворившихся денатурированных баластных белков. Центрифугат объемом 1,25 л имеет рН 6,0. Раствором 1 н соляной кислоты доводят рН до 5,2 и производят осаждение липопротеидных примесей смесью спиртахлороформа, приливая к центрифугату при перемешивании 0,453 л этилового спирта и 50 мл хлороформа до конечной концентрации этих ингредиентов соответственно 24 и 4 об.%. Смесь перемешивают 30 мин при 24°С и образовавшийся осадок отделяют центрифугированием в течение 1 ч при 3 тыс. об/мин. Получают 1,6 л центрифугата, к которому для осаждения церулоплазмина добавляют при перемешивании 0,6 л охлажденного до 0°С этилового спирта и оставляют для формирования осадка церулоплазмина при минус 10°С на 18 ч. Образовавшийся осадок получают центрифугированием при 3 тыс. об/мин в течение 1ч. 25 г получившегося осадка растворяют, подвергают стерилизующей фильтрации и лиофилизируют. Выход препарата в данном примере составляет 0,5 г церулоплазмина на 1 кг сырья, его оптический коэффициент 0,041; диологическая активность 16,2 усл.ед. Препарат алирогенный. 5 10 15 20 25 30 П р и м е р 2. 30 кг фракции III по Кону плацентраной сыворотки, хранившейся в течение 1 мес гомогенизируют в 150л0,05М 35 раствора натрия хлористого. К гомогенату добавляют 3,5 кгДЭАЭ-целлюлозу, доводят рН смеси до 6,3 и оставляют при слабом перемешивании на 16 ч при4°С. Целлюлозу с сорбированным церулоплазмином отмы- 40 вают от баластных белков на нутч-фильтре через хлопчатобумажную ткань 2100 л охлажденного 0,08 М раствора натрия хлористого до оптической плотности на выходе Е280=0,110. Затем сорбент переносят в хро- 45 матографическую колонку и производят десорбцию церулоплазмина 0,15 М раствором натрия хлористого при 4°С. Полученные 8,5 л элюата осаждают охлажденным этиловым спиртом до конечной концентрации 75 50 об.% и осадок отделяют центрифугированием при 12 тыс.об/мин 1 ч; 380 г осадка растворяют в 1 л 0,26 М растворе натрия хлористого, центрифугируют в течение 1 ч для отделения нерастворившихся денатури- 55 рованных баластных белков, доводят рН до 5,3 и к полученному 1,25 л центрифугату добавляют 0,0453 л этилового спирта и 50 мл хлороформа. Смесь перемешивают при 24°Св течение 30 мин и образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при 3 тыс. об/мин в течение 1 ч; 1,5 л центрифугата выдерживают 12 ч при минус 10°С, добавляя к нему при перемешивании 0,62 л этилового спирта, чтобы конечная концентрация спирта в растворе составляла 55 об.%. Получено 31 г осадка, раствор которого был подвергнут стерилизующей фильтрации и лиофилизации. Выход препарата в данном примере составляет 0,4 г церулоплазмина на 1 кг сырья, его оптический коэффициент 0,043, биологическая активность 15,9 улс.ед., препарат апирогенный. П р и м е р 3. 33 кг осадка фракции III по Кону плацентарной сыворотки, хранившейся 2 мес, гомогенизируют в 160 л 0,05 М растворе натрия хлористого. К гомогенату добавляют 3,5 кг ДЭАЭ-целлюлозу, доводят рН до 6,3 и оставляют при слабом перемешивании на 16 ч при 4°С. После сорбции целлюлозу отмывают от баластных белков на нутч-фильтре через хлопчатобумажную ткань 0,08 М раствором хлористого натрия до оптической плотности на выходе при Е280=0,115. Отмытый сорбент переносят в хроматографическую колонку и производят десорбцию церулоплазмина охлажденным 0,17 М раствором натрия хлористого при 4°С. Полученные 9 л элюата осаждают охлажденным этиловым спиртом до конечной концентрации 70 об.% и полуфабрикат церулоплазмина отделяют центрифугированием при 12 тыс. об/мин в течение 1 ч 400 г осадка растворяют в 1л 0,25 М растворе натрия хлористого, центрифугируют для отделения баластных нерастворившихся белков при 6 тыс. об/мин в течение 1 ч, доводят рН до 5,3 и к полученным 1,3 л центрифугата добавляют 0,46 л этилового спирта и 52 мл хлороформа. Смесь перемешивают при 24°С в течение 30 мин и образовавшийся осадок липопротеинов отделяют центрифугированием при 3 тыс. об/мин в течение 1 ч. К1,8 л центрифугата добавляют при перемешивании 0,7 л охлажденного этилового спирта, доведя его конечную концентрацию до 55 об.%, и оставляют для формирования осадка церулоплазмина при минус 10°С. Было получено 32 г осадка. Выход церулоплазмина в данном примере составлял 0,5 г белка из 1 кг сырья, его биологическая активность 16,5 усл.ед., оптический коэффици: ент 0,043, препарат апирогенный. П р и м е р 4, 35 кг осадка фракции 3 по Кону гомогенизировали в 185 л 0,05 М растворе натрия хлористого. К гомогенату добавили 3,5 кг ДЭАЭ-целлюлозы, довели рН до 6,3 и произвели сор'бцию церулоплазмина (18 ч, 4°С). После отмывки сорбента от бал 1607137 ластных белков перенесли его в хроматографическую колонку и элюировали церулоплазмин 0,16 М раствором охлажденного натрия хлористого. Полученные 8 л элюата осадили этиловым спиртом в конечной его 5 концентрации 70 об.% и центрифугированием при 12 тыс. об/мин в течение 1 ч. Осадок полуфабриката церулоплазмина в количестве 300 г растворили в 1 л 0,24 М раствора натрия хлористого, центрифугиро- 10 вали 1 ч при 6 тыс. об/мин и к центрифугату после доведения рН до 5,3 добавили 0,550 л этилового спирта и 40 мл хлороформа до конечной концентрации соответственно 26 и 2 об.%. Смесь перемешивали при 26°С в 15 течение 25 мин и центрифугировали при 3 тыс. об/мин 1 ч. К 1,8 л центрифугата добавили этиловый спирт до конечной концентрации его 45 об.% и оставили для фор* мирования осадка при минус 15°С. 20 Получили 35 г церулоплазмина, который подвергали стерилизующей фильтрации и лиофилизировали. Выход препарата в данном примере составляют 0,45 г на 1 кг сырья. Его оптический коэффициент-0.042. 25 биологическая активность 16,3 усл.ед. на мг белка. Препарат апирогенен. электрофорегического фракционирования иерулоплазмина. Формула изобретения Способ получения церулоплазмина путем гомогенизации III фракции по Кону отходов производства при получении гамма-глобулинов в растворе хлористого натрия, сорбции полученного гомогената на ДЭАЭ-целлюлозе, элюции двухкратного осаждения целевого продукта, этиловым спиртом осаждения образовавшегося осадка церулоплазмина центрифугированием при-^изкой температуре, его растворения, стерилизующей фильтрации и лиофильного высушивания, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что. с целью устранения пирогенности и повышения степени очистки, элюцию с ДЭАЭцеллюлозы осуществляют 0,15-0,17 М раствором хлористого натрия, после элюции целевой продукт осаждают этиловым спиртом до конечной концентрации 6575 об.%. осадок растворяют в 0,25-0,26 М раствора хлористого натрия, центрифугируют, доводят рН центрифугата до 5,2-5,3 и температуру до 24~26°С, осаждение церулоплазмина проводят добавлением этилового спирта и хлороформа до конечной В табл.1 и 2 приведены данные по опконцентрации соответственно 24-26 и 2ределению пирогенности в используемом 4об.%, перемешивают в течение 25-30 мин, сырье и в конечном препарате церулоплаз- 30 образовавшийся осадок удаляют центрифумина. гированием, повторное осаждение целевоПредлагаемый способ позволяет полуго продукта этиловым спиртом проводят из чить апирогенный целевой продукт из занэдосадочной жидкости в концентрации ведомо пирогенного сырья. В результате 45-55 об.% выдерживают 12-18 ч при минус осуществления способа устраняются 35 10-15°С. также ряд примесей см. денситограмму Таблица 1 Образец Срок хранения, мес 1 2 3 Свежий 4 1.3 ! • 5 6 7 8 9 10 1,0 1,5 1.0 2,0 1.5 Свежий 1.3 1,0 Величина максимального повышения температуры .2-й кроль 1-й кроль 3-й кроль 0,8 0.9 1,2 1,3 0.7 1,2 0,8 0.7 0,8 0,7 0,5 0,9 1,0 0,8 0,6 0,5 1.4 1.3 0,9 1.0 * 1.2 0.6 0,8 0,6 . 0,7 0,8 0.6 0.7 0,8 1,0 Сумма величин максимального повышения температуры 2,1 2.4 2,7 4,0 2,3 3.0 2.6 2,0 2,4 2,3 1607137 Таблица 2 Образец Величина максимального повышения температуры 1- й кроль 2- й кроль 3-й кроль • 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Редактор С.Рекова 0 0,3 0,6 0,3 0 0,3 0,2 0,1 0,5 0 0,2 0,4 0,7 0,3 0,2 0,3 0,3 0,2 0,3 0,3 0,1 0,5 0,5 0,6 0,5 0,4 0,4 0,2 0,4 0 Сумма величин максимальных подьемов температуры 0,3 1,2 J 1,8 1,2 0,7 1,0 0,9 0,5 1,2 0,3 Составитель С.Мельникова Техред М.Моргентал Корректор И.Эрдейи Заказ 3914/ДСП Тираж 413 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 і