Спосіб лабораторної діагностики вірусних хвороб хребетних

Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для лабораторной диагностики вирусных болезней позвоночных (человека, животных, птиц). Наиболее близким техническим решением является реакция нейтрализации вирусов (РН), включающая смешивание разведений исследуемой сыворотки с постоянной дозой вируса, инкубацию смеси в течение 1-2 часов при избранной температуре (4, 18 или 37°С), внесение этой смеси в чувствительную культур у клеток, контакт смеси с клетками в течение 2 часов, далее инкубацию клеток с исследуемой смесью и поддерживающей средой в течение 72-240 часов, затем визуальный учет результатов [1]. Однако РН невозможно провести для вирусов, размножающихся без цитопатического действия на клетки (например, вирусы классической чумы свиней, лейкоза) или вирусов с замедленным циклом репродукции (например, герпесвирусы), а также с вирусами, вызывающими хронические или персистентные инфекции (например, некоторые штаммы вируса КЧС). Учет результатов крайне затруднен и в случае недостаточного количества вируса, что обычно наблюдается в нативном (полевом) материале и поэтому требует предварительно чрезвычайно трудоемкого и длительного по времени выделения и/или пассирования вируса с помощью клеточных культур, заражения лабораторных животных или куриных эмбрионов. Задачей изобретения является упрощение и удешевление постановки диагноза, повышение чувствительности, универсальности, экспрессности и специфичности реакции. Поставленная задача решается тем, что .'гач'Зораторная диагностика вирусов осуществляется в два этапа: I индикация вирусов проводится по феномену активации мембран чувствительных культур клеток с помощью флуоресцентных зондов ДСМ (4-п-диметиламйностирил-1 метилпиридиния п-толуолсульфонат) или ДСП-6 (4-п-диметиламиностирил-1 гексилпиридиния п-толуолсульфонат) (Ин-т оргеин-тоза. г. Рига, Латвия), фотометрического устройства ФМЭЛ-1 и флуоресцентного микроскопа ЛЮМАМ И-2 (ЛОМО, Санкт-Петврбург). II идентификация вирусов проводится с помощью панели вирусспецифических моно- или поликлональных антител с помощью модифицированной реакции нейтрализации (МРН) и флуоресцентного зонда ДСМ (ДСП6) по феномену торможения адсорбции вируса гомологичными антителами на клеї очной мембране. При образовании иммунного комплекса "вирус-антитело" вирус теряет способность связываться со специфическими рецепторами клетки и состояние мембраны клеток не изменяется. В исследованиях с помощью флуоресцентных зондов более чем 1000 вируссодержащих проб суспензии афтозного эпителия свиней, КРС и морских свинок, инфицированных пикорнавирусами, выявили достоверное (в 1,5 и больше раза) увеличение флуоресценции инфицированных клеток по сравнению с интактными. Согласно оценке существенности различий выборок из 200 проб инфицированной и контрольной суспензии клеток (Программа "Statgraph". 1993], значения показателя флуоресценции К, равное и больше 1,5 стали считать диагностическим, так как он удовлетворял априорную вероятность Ρ ≤ 0,01, то есть достоверное различие между интактными и инфицированными клетками по степени флуоресценции зонда наблюдалось не менее чем в 99,9% случаев [2]. Для обоснования временного интервала инкубации системы "вирус-клетка" мы провели серию экспериментов по исследованию динамики сорбции вируса ящура (тип А22 , шт. № 550) на монослой культуры клеток СП. В результате установлено, что сорбция вируса в основном завершилась первые 5 мин экспозиции образца с чувствительными клетками (надосадок содержал лишь 0,8± ±0,32% БОЕ рабочей дозы вируса), а интенсификация флуоресценции совпадала с максимумом сорбции вируса на клетку. Отсюда были сделаны выводы, что активация клеточной мембраны, связанная с вирусной инфекцией, может быть выявлена с помощью флуоресцентных зондов на стадии адсорбции вируса на клетку; наиболее целесообразным является время инкубации системы "вирус-клетка" в пределах 15-30 минут. Это обеспечивает специфическую сорбцию вирусов на рецепторы клеток-мишеней и является необходимым и достаточным условием для получения достоверных результатов. Время экспозиции образцов с зондом было найдено экспериментально, по установлению равновесного количества зонда вне клетки и внутри нее. Расчеты велись по модифицированному уравнению Нернста где См - концентрация зонда внутри клетки, Свн - концентрация зонда во внешней среде, в результате чего было определено время 12-15 мин экспозиции с клетками. Вышеизложенные эксперименты послужили основой для разработки способа лабораторной диагностики болезней позвоночных вирусной этиологии. Таким образом, для индикации вирусов 0,1 мл вируссодержащего материала вносят в 0,5 мл клеточной суспензии, инкубируют при 36-38°С 15-20 мин, затем вносят 60 мкл флуоресцентного зонда ДСМ (ДСП-6) и через 12-15 мин ведут учет результатов по отношению интенсивности флуоресценции смеси в опыте и контроле, и при значении показателя флуоресценции К, равном 1,5 и выше, определяют наличие вируса в исследуемой пробе. Для идентификации вируса 0,1 мл вируссодержащей суспензии смешивают с 0,1 мл сыворотки с известным титром антител, смесь перемешивают обычным способом и вносят в 0,5 мл суспензии чувствительной культуры" клеток на 15-20 минут. Далее добавляют 60 мкл флуоресцентного зонда ДСМ (ДСП-6) и экспонируют при температуре 36-38°С 15 мин, после чего осуществляют учет результатов по показателю флуоресценции К. При значении К < 1,5 определяют таксономическую принадлежность вируса (семейство, род, вид, тип и т.д.). Пример 1. Идентификация вирусов -возбудителей болезней с везикулярным синдромом. Проводят индикацию и идентификацию вирусов в исследуемой пробе так, как описано выше. Подготовленные образцы флуометрируют с помощью микроскопа ЛЮМАМ И-2 и фотометрического устройства ФМЭЛ-1 при длине волны возбуждающего света 450 им и длине волны флуоресценции 515 нм. Среднюю интенсивность флуоресценции (F ) клеток рассчитывают по формуле: i =1 F = 1/ nå Fi, n Fi - интенсивность флуоресценции і-той клетки; n - число клеток (не менее 25). Для удобства и сопоставимости результатов ввели константу флуоресценции (К) — показатель, равный отношению F опыта / F контроля. К ≥ 1,5 свидетельствует о наличии вируса в исследуемой пробе, К < 1,5 - о нейтрализации вируса. Вирус относят к тому виду, антителами которого он нейтрализован (см. таблицу). Предлагаемый способ обладает: экепрессностью (полая идентификация вируса в материалах различного происхождения протекает за 3060 мин против 72-240 часов в реакции нейтрализации); универсальностью (предлагаемый способ испытан с положительными результатами на моделях возбудителей 25 болезней человека, животных и птиц 13 семейств); специфичностью; возможностью изучения новых, неизвестных и экзотических вирусных болезней и их этиологических агентов; возможность диагностики ι мешанных инфекций (пример 1); возможностью работы с вирусами, не вызывающими цитопатический эффект в культуре клеток или плохо культивируемыми.