Експрес-метод виявлення віруснейтралізуючих антитіл в моно- і полівалентних сироватках крові

Изобретение относится к области иммунологии и может быть использовано для выявления и идентификации вируснейтрализующи х антител в моно- и поливалентных сыворотках. Наиболее близким техническим решением изобретения является реакция нейтрализации вирусов (PH), включающая смешивание рабочих разведений сыворотки с постоянной дозой вируса, инкубацию смеси в течение 1 - 2 часов (37°C), внесение этой смеси в чувствительную культуру клеток, контакт смеси с клетками в течение 2 часов, инкубацию смеси с клетками при 37°C 72 - 240 часов, затем визуальный учет результатов [1]. Недостатками известного способа являются: визуальный учет результатов; трудоемкость и длительность реакции; невозможность работы с моноклинальными антителами; невозможность постановки реакции с вирусами, не вызывающими ЦПД. Для определения нейтрализующей активности продуктов синтеза гибридом (моноклональные антитела МАт) используют иммуноферментный метод (МФМ), протекающий в 2 этапа: Антигены иммобилизуют на поверхности пластиковых панелей и к ним добавляют надосадочную жидкость из культургибридных клеток. Связывание моноклональных антител (МАт) с антигеном определяют, инкубируя полученный комплекс с мечеными ферментом антителами к МАт. Ча ще всего в реакциях используют продукты, синтезируемые гибридными клетками мыши. Тогда инкубируют конъюгат фермент-кроличьи Ат к IgG мыши. Если излучаемые МАт специфичны к растворимым белкам, то их выявляют с помощью антигеном, неспецифически адсорбированных на поверхности пластика [2]. Однако, кроме трудоемкости и сложности описанных этапов, отмечают большие трудности использования ИФМ из-за повышенного уровня фона, создаваемого ферментативной активностью внутри клеток или на их поверхности. Помимо всего, учет результатов ведется визуально, что также вызывает трудности в оценке результатов. В основу изобретения поставлена задача: создать метод, устраняющий перечисленные недостатки прототипов и обладающий новыми качествами, как экспрессность, универсальность, количественный учет результатов, простота постановки реакции. Поставленная задача решается тем, что в соответствии с изобретением учет результатов реакции проводят по значению показателя флуоресценции К, равному количественно измеренному отношению флуоресценции пробы "МАт или поликлональные антитела + вирус" к флуоресценции контрольной пробы "вирус + известная гомологичная сыворотка к этому вирусу". В соответствии со стандартами МЭБ, ставятся контроли: "обратное" титрование используемого вируса (контроль его рабочей дозы); контроль чувствительности культуры клеток; контроль системы "вирус + номальная сыворотка" и "вирус + гомологичная сыворотка к этому вирусу" [3]. Способ основан на феномене нейтрализации вируса специфичными антителами и на разнице в действии вируса и иммунного комплекса " вирус-антитело" на клетку-мишень. При отсутствии специфичных антител адсорбция вируса на клетку приводит к активации клеточных мембран и достоверному (в 1,5 и более раз)увеличению флуоресцении инфицированных клеток, что регистрируется с помощью флуоресцентных зондов ДСМ (4-п-диметияаминостирил-1 метилпиридиния птолуолсульфонат) или ДСП-6 и фотометра "ЛЮМAM И-2". Нейтрализация вируса специфичными антителами блокирует активацию мембран под действием вируса, препятствует е го сорбции на клетки, вследствие чего изменений состояния мембран клетки-мишени не наблюдается (показатель флуоресценции К при этом меньше 1,5). На основе полученных значений показателя флуоресценции К делается вывод о наличии или отсутствии в сыворотках нейтрализующих антител к известному вир усу. Таким образом, значения показателя флуоресценции К меньше 1,5 свидетельствуе т об образовании иммунного комплекса "вирус-антитело", а значит, о наличии в испытуемой моно- или поликлональной сыворотке антител с нейтрализующей активностью к известному вирусу. Значения К 1,5 свидетельствуют об отсутствии в испытуемой сыворотке нейтрализующих антител к известному вирусу. Продолжительность исследования - 60 минут. Достоверность получаемых результатов составляет 99,9% (по коэффициенту парной корреляции между выборками; программа "Statgraph" ВЦВНИИЗЖ. 1993) [4]. Для обоснования временного интервала инкубации системы "вирус-антитело-клетка" мы провели серию экспериментов по исследованию динамики сорбции вируса ящура (тип A22, шт. №550) на монослой культуры клеток СП. В результате установлено, что сорбция вируса в основном завершилась в первые 5мин экспозиции образца с чувствительными клетками (надосадок содержал лишь 0,8 ± 0,32% БОЕ рабочей дозы вируса), а интенсификация флуоресценции совпадала с максимумом сорбции вируса на клетку. Отсюда были сделаны выводы, что активация клеточной мембраны, связанная с вирусной инфекцией, может быть выявлена с помощью флуоресцентных зондов на стадии адсорбции вируса на клетку; наиболее целесообразным является время инкубации системы "вирус-клетка" в пределах 15 - 30 минут. Это обеспечивает специфическую сорбцию вирусов на рецепторы клеток-мишеней и является необходимым и достаточным условием для получения достоверных результатов. Время экспозиции образцов с зондом было найдено экспериментально, по установлению равновесного количества зонда вне клетки и внутри нее. Расчеты велись по кодифицированному уравнению Нернста где Cвкл - концентрация зонда в клетке; Cан - концентрация зонда во внешней среде, в результате чего было определено время 12 - 15мин экспозиции с клетками. Пример 1. Выявление и титрование антител в моно- и поливалентных сыворотках к пестивирусам, присланных в рамках международного эксперимента "Inter-laboratory comparison test for antibodies against Classical Swine Fever virus. - July, 1996" (Пулава, Польша, июль 1996). Берут два ряда пробирок с пробками. В первом ряду готовят последовательные 10-кратные (2х; 3х и т.п.) разведения исследуемых сывороток на 0,5% ГЛА или среде Игла. Во второй ряд пробирок переносят по 0,1мл каждого разведения и добавляют по 0,1мл рабочего разведения референтного вируса с известным титром, перемешивают встряхиванием. Далее полученной смесью каждого разведения по 0,1мл инокулируют 0,5мл суспензии чувствительной культуры клеток (1 проба - 1 флакон), встряхивают, инкубируют при 36 - 38°C 20 минут, в каждый флакон добавляют 60мкл флуоресцентного зонда ДСМ или СДП-6 и экспонируют 15 минут, после чего образец фотометрируют с помощью люминесцентного микроскопа "ЛЮМАМ", фотометрического устройства ФМЭЛ-1 и счетного цифрового прибора Щ-4300. За единицу измерения принимают среднее значение интенсивности флуоресценции 25 интактных клеток контрольной суспензии, вычисленной по формуле где Fi - значение флуоресценции i-клетки; n - число клеток (не меньше 25). Для удобства и сопоставимости результатов введен показатель флуоресценции K, равный отношению флуоресценции пробы "испытуемая сыворотка + вирус" к контрольной пробе "вирус + гомологичная сыворотка к этому вирусу" При K < 1,5 в сыворотке есть моно- или поликлональные антитела с нейтрализующей активностью к этому вирусу. Предлагаемый метод обладает: экспрессностью (30 - 60мин против 72 - 240час в реакции нейтрализации, 2час в реакции ИФА); универсальностью (метод испытан с положительными результатами на моделях 10 вирусов 7 семейств); специфичностью (получены положительные результаты в рамках международного эксперимента по выявлению нейтрализующих антител к антигенно родственным вирусам классической чумы свиней и вирусной диареи КРС (Пулава, Польша, 1996); высокой чувствительностью (метод взят в сравнение с международным стандартным методом NPLA); возможностью ретроспективной диагностики смешанных инфекций; упрощением постановки реакции и возможностью работы как с моновалентными, так и поликлональными антителами.