Спосіб оцінки стану мембран лімфоцитів

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологическим способам исследования и может применяться для оценки состояния мембран лимфоцитов и лечебнопрофилактических и научно-исследовательских учреждениях, занимающихся вопросами диагностики и лечения вторичных иммумодефицитов. Известны способы оценки состояния мембран лимфоцитов путем использования флуоресцентных зондов. Однако эти способы трудоемки, требуют дефицитных дорогостоящих реактивов, малоинформативны для клиники, поскольку позволяют судить только о локальных изменениях липидов, окружающих зонд, но не о состоянии всей мембраны в целом. Кроме того возможна миграция энергии на близлежащие к зонду молекулы, что искажает результаты, снижает информативность и точность исследования [1]. Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является способ исследования состояния мембран лимфоцитов, с использованием тонкослойной хроматографии. Однако данный способ требует большого количества биологического материала и практически неприменим для изучения состояния мембран лимфоцитов крови в условиях клиники. Кроме того, способ многоэтапный, значительный процент потерь материала на каждом обуславливает низкую точность исследования. За счет диффузного распределения фракций липидов и неоднородности их окраски возможны погрешности при учете результатов, что снижает воспроизводимость способа и его информативность. Все это относит данный способ в разряд полуколичественных [2]. В основе предлагаемого изобретения доставлена задача создать способ, который позволил бы оценивать типы изменений мембран лимфоцитов при различных заболеваниях человека и диагносцировать начало формирования нарушений в системе иммунитета до развития клинических признаков заболевания для своевременного проведения лечебнопрофилактических мероприятий. Задача достигается тем, что, согласно изобретению, в предлагаемом способе определяют индекс ненасыщенности жирных кислот фосфолипидов и концентрацию свободного холестерина и при значении первого выше 1,5 и второго выше 10нг/ на 1млн клеток устанавливают активацию, при значениях первого ниже 0,7 и второго выше 10нг/1млн клеток - напряжение, призначеннях первого ниже 0,7 и второго ниже 0,3нг/1млн клеток устанавливают декомпенсацию липидного метаболизма. Таким образом производится определение 3 вариантов состояния мембран лимфоцитов, что позволяет судить об интенсивности и направленности изменений в мембранах иммунокомпетентных клеток. Сравнение заявляемого способа с прототипом позволяет установить его соответствие критерию "новизна", поскольку использование отношения индекса ненасыщенности жирных кислот фосфолипидов и показателя концентрации свободного холестерина при оценке мембран лимфоцитов проводится впервые. При изучении други х известных те хнических решений в данной области указанные параметры, определяющие 3 варианта состояния изучаемого объекта, позволяющие выявлять доклинические изменения мембран лимфоцитов и отличающие заявляемый способ от прототипа не были заявлены, что обеспечивает заявляемому способу соответствие критерию "новизна". В отношении соблюдения критерия "существенные отличия" можно сказать, что предлагаемый способ впервые предусматривает использование соотношения показателей концентрации жирны.х кислот фосфолипидов и свободного холестерина - основных стр уктурных и функциональных компонентов липидного комплекса мембран лимфоцитов, во-вторых предлагаемое изобретение создает возможность оценки 3 вариантов состояния мембран лимфоцитов, что способствует повышению информативности исследования и в-третьих позволяет проводить доклиническую оценку изменений мембран лимфоцитов. Целесообразность использования соотношения индекса ненасыщенности и концентрации свободного холестерина определяется необходимостью повышения информативности, упрощения и повышения точности оценки состояния мембран лимфоцитов при соматической патологии и формировании вторичных иммунодефицитов для их своевременной терапии. Методика отличается высокой точностью и позволяет определять нг вещества. Исследование 2 показателей проводится в одной пробе, что упрощает исследование и повышает его точность. Этапы процесса - забор и выделение лимфоцитов крови у пациента, экстракция липидов по Фолчу (2), метелирование жирных кислот, газохроматографическое определение концентрации жирных кислот и свободного холестерина, вычисление индекса ненасыщенности и содержания свободного холестерина в мембранах и при значении первого выше 1,5 и второго выше 10нг/1млн клеток устанавливают активацию, при значениях первого ниже 0,7 и второго выше 10нг/1млн клеток напряжение, при значениях первого ниже 0,7 и второго ниже 0,3нг/1млн клеток устанавливают декомпенсацию липидного метаболизма. Таким образом, предлагаемый способ представляет собой новый подход к решению поставленной задачи оценке мембран лимфоцитов. Он действительно имеет преимущества по сравнению с аналогом и прототипом по точности, воспроизводимости, информативности доступности для клиники и позволяет не только констатировать нарушения липидного состава мембран лимфоцитов, но на основании точного количественного анализа оценивать соотношение ключевых факторов липидного метаболизма в мембранах лимфоцитов, выявлять интенсивность и направленность этих изменений, проводить их доклиническую классификацию на 3 варианта и оценивать степень повреждений для своевременной их профилактики. Способ перспективен в клинической практике для оценки состояния мембран и доклинического выявления формирующихся вторичных иммунодефицитов. Способ осуществляется следующим образом. Из 2мл гепаринизированной крови пациента выделяют лимфоциты, доводят их концентрацию средой 199 с 5%, АВ - сывороткой до 2млн/мл и выделяют липиды по общепринятому методу Фолча. Фосфолипиды осаждают ацетоном на холоду и в осадке, после метилирования с 5мл 1% H2SO4 в течение 20 минут определяют концентрацию жирных кислот на газовом хроматографе. В ацетоновом экстракте после упаривания газохроматографически оценивают содержание свободного холестерина. Вычисляют отношение суммы насыщенных жирных кислот к ненасыщеным - индекс ненасыщенности и при значениях его выше 1,5 и концентрации свободного холестерина выше 10нг/1млн клеток устанавливают активацию, при значениях первого ниже 0,7 и второго выше 10нг/1млн клеток напряжение, при значениях первого ниже 0,7 и второго ниже 0,3нг/1млн клеток устанавливают декомпенсацию липидного метаболизма в мембранах лимфоцитов. Преимущества предлагаемого технического решения по сравнению с прототипом. При проведении сравнительной оценки состояния мембран лимфоцитов с помощью нашего способа и способа-прототипа получены результаты, которые приведены в таблице. В результате у лиц с развившимися вторичными иммунодефицитами при определении по способу-прототипу только в 40% выявляются изменения мембран лимфоцитов, а нашим способом - в 96%, что подтверждает более высокую точность исследования. При определении нашим способом получены различные варианты состояния мембран лимфоцитов, требующие различного подхода к их коррекции, а при исследовании по способупрототипу выявить эти изменения не удается, что говорит о более высокой информативности заявляемого технического решения. Таким образом, наш способ является более информативным для клинической практики, позволяет оценивать состояние мембран лимфоцитов с более высокой точностью, чем в прототипе, проводить доклиническую оценку этих изменений и использовать для исследования всего 2мл крови, в то время как для выполнения способа-прототипа требуется выделять лимфоциты из 20 - 30мл крови. Преимущества предлагаемого изобретения: 1) повышение информативности исследования; 2) сокращение времени исследования; 3) упрощение исследования; 4) повышение точности исследования.