Тест-система на основі мікрометоду реакції нейтралізації для діагностики вірусного артеріїту коней

Корисна модель відноситься до ветеринарної вірусології, зокрема до лабораторної діагностики, призначена для виявлення віруснейтралізуючих антитіл до вірусу артеріїту коней в сироватках крові коней, а також для ідентифікації виділеного вірусу, що дозволить своєчасно застосовувати лікувально-профілактичні заходи та зменшити економічні збитки у конярських господарствах. Аналог корисної моделі - реакція зв'язування комплементу (РЗК). Принцип реакції заключається в тому, що на першому етапі реакції беруть участь антиген, антитіла і комплемент. При відповідності антигену і антитіл їх комплекс зв'язує комплемент, що виявляється на другому етапі з допомогою індикаторної системи (суміш баранячих еритроцитів і антисироватки до них). Якщо комплемент зв'язався при взаємодії антигену і антитіл, то лізіс баранячих еритроцитів не відбувається (позитивна РЗК). При негативній РЗК незв'язаний комплемент сприяє гемолізу, за яким судять про результати реакції. Недоліком вказаного методу є те, що він досить громіздкий, потребує великих затрат праці, недостатньо чутливий і недостатньо специфічний. Найближчим аналогом корисної моделі є найбільш близька за технічним рішенням до корисної моделі реакція нейтралізації (РН), що включає змішування двократних розведень сироваток з постійною дозою вірусу, інкубацію суміші протягом 1-2 годин при 37°С, зараження нею чутливи х тест-об'єктів (культури клітин у пробірках), спостереження за тест-об'єктами. Результати РН в культурі клітин враховують по цитопатичній дії (ЦПД), на мишах і курячих ембріонах - по їх загибелі [1-5]. Недоліком реакції нейтралізації являється: використання значних об'ємів реагентів, великої кількості посуду, трудомісткість, тривалість реакції. Використання РН при масових обстеженнях у господарствах дуже ускладнено. В основу корисної моделі поставлено завдання розробити тест-систему, яка б усувала перераховані недоліки найближчого аналога і володіла новими якісними показниками, такими як скорочення витрат реагентів, посуду, часу обліку результатів досліду, спрощення постановки реакції. Поставлене завдання вирішується завдяки тому, що використовується мікрометод із одночасним внесенням дослідних проб, 96 лункові планшети, восьми канальна автоматична піпетка, комплемент. Суть корисної моделі в тому, що в розробленій тест-системі в десять раз скорочуються витрати реагентів, використання 96 лункових планшетів і автоматичної восьмиканальної піпетки полегшує і прискорює постановку реакції. Використання комплементу підвищує чутливість і специфічність реакції. Одночасне внесення компонентів полегшує постановку реакції і скорочує тривалість дослідження на 2 доби. Спосіб застосування мікрометоду реакції нейтралізації: вміст флакону з вірусом розчиняють 1,0см 3 дистильованої води (рН7,2-7,4) і готують робоче розведення вірусу, що містить в 1см 3 100 ТЦД50, розводячи вірус середовищем з антибіотиками, без сироватки і з додаванням комплементу до кінцевої концентрації 10%. Специфічну і негативн у сироватки розчиняють в 1см 3 стерильної дистильованої води. Сироватки, що досліджують, прогрівають при 56±0,5°С і розтитровують підтримуючим середовищем в 96 лунковому планшеті від 1:2 до 1:512 використовуючи метод подвійних розведень. Для цього в лунки планшета вносять по 50мкл підтримуючого середовища. В першу лунку вносять 50мкл сироватки, піпетують три рази для змішування і 50мкл суміші переносять в наступну. Аналогічно, послідовним переносом, отримують двократні розведення сироваток. Робоче розведення вірусу додають до розведень сироваток по 50мкл. Одночасно ставлять контролі: - контроль культури клітин; в 4 лунки планшета вносять 100мкл підтримуючого середовища; - контроль токсичності сироваток; в 4 лунки вносять по 100мкл досліджуваних сироваток в найменшому розведенні, яке використовувалось в реакції; - контроль робочого розведення вірусу; з робочого розведення вірусу готують 4 ряди десятикратних розведень. Для цього в першу лунку вносять по 50мкл підтримуючого середовища, в інші - по 90; в першу лунку додають 50мкл робочого розведення вірусу змінивши наконечники піпетують для змішування і в наступн у переносять 10мкл; аналогічно, послідовним переносом, отримують інші розведення; - контроль специфічної сироватки; в 4 лунки вносять суміш вірусу і специфічної сироватки (50мкл робочого розведення вірусу і 50мкл сироватки); - контроль негативної сироватки; в 4 лунки вносять суміш вірусу і негативної сироватки (50мкл робочого розведення вірусу і 50мкл сироватки). Сироватки і вірус змішують коловими рухами планшета, і ставлять на 1 годину в СО2 інкубатор для контакту вірусу з сироватками. Потім в кожну лунку додають по 100мкл підготовленої суспензії культури клітин з концентрацією 500-540тис. клітин на см 3 і ставлять для культивування в CO2 інкубатор. Облік результатів реакції з контролями проводять 4 доби щодня шляхом перегляду в бінокулярному інвертованому мікроскопі. Через 18-24 години починає утворюватися суцільний моношар клітин, а дія вірусу починає проявлятися через 24 години. В контролі клітин і при нейтралізації вірусу утворюється суцільний моношар, а де діє вірус, видно ЦПД на клітинах. Реакцію враховують по відсутності ЦПД на культурі в лунках з контролем культури, досліджуваними та позитивною сироватками та при наявності ЦПД у контролях вірусу. В контролях культурах клітин повинні бути відсутні сліди дегенерації клітин. Титр сироваток розраховують за Рідом і Менчем і виражають в логарифмі з основою 2. Діагностичним титром проти 100 ТЦД50/см 3 вірусу вважають розведення сироватки 1:4 і більше. Для ідентифікації виділених вірусів ставлять реакцію нейтралізації мікрометодом на 96 лункових планшетах використовуючи 100 ТЦД50 вірусу і 20 нейтралізуючих доз сироватки, розведення для яких отримують виходячи з титру антитіл в сироватці. Наприклад при титрі антитіл 1:512 для отримання 20 нейтралізуючих доз в її розводять 1:25,6. Робоче розведення вірусу го тують розводячи вірус середовищем з антибіотиками, без сироватки і з додаванням комплементу до кінцевої концентрації 10%. Кожний з досліджуваних вірусів в робочому розведенні 100 ТЦД50/см 3 розносять в лунки планшета для культивування клітин по 50мкл і до них додають по 50мкл позитивної до вірусу артеріїту коней сироватки, змішують коловими рухами планшета, і ставлять на 1 годину в СО2 інкубатор для контакту вірусів з сироваткою. Контролі ставлять ті самі, що і в мікрометоді реакції нейтралізації при виявленні антитіл в сироватках крові. Після витримки для контакту в кожну з лунок вносять по 100мкл підготовленої суспензії культури клітин з концентрацією 500-540тис. клітин на см 3 і ставлять для культивування в СО2 інкубатор. Облік результатів реакції з контролями проводять на 2-5 добу шляхом перегляду в бінокулярному інвертованому мікроскопі, при прояві ЦПД в контролях вірусу. Якщо сироватка нейтралізує не менше ніж у 50% заражених лунок - досліджуваний вірус - вірус артеріїту коней. Експериментальні дослідження показали, що розроблений спосіб з набором діагностиків для мікрометоду РН, являється високочутливим, специфічним, мало трудомістким. Дана тест-система дозволяє проводити дослідження із значною економією антигену і контрольних сироваток. Таким чином розроблена тест-система на основі мікрометоду реакції нейтралізації для діагностики вірусного артеріїту коней дає можливість виявляти віруснейтралізуючі антитіла в сироватках крові коней і ідентифікувати виділені віруси за 4-5 діб. Реакція високочутлива, специфічна, може застосовуватись для масових діагностичних обстежень. Тест-система знайде застосування у вірусологічних лабораторіях ветеринарної медицини та науководослідних установах. Література: 1. Галатюк О.Є. Заразні хвороби коней - Житомир: Видавництво "Волинь", 2003. -280с. 2. Иммунологическая диагностика вирусных инфекций /Под ред. Т.В. Перадзе, П. Халонена. Совместное издание СССР - Финляндия. - М.: Медицина, 1985. -302с. 3. Практикум по ветеринарной вирусологии /Н.И. Троценко, Р.В. Белоусова, Э.А. Преображенская. - М.: Агропромиздат, 1989. -287с. 4. Старчеус А.Л ., Ображей А.Ф. Вірусний артеріїт //Вір усні хвороби коней. К., 1991. С.21 -47. 5. Юров К.П. Инфекционные аборты у кобыл и их профилактика. М.: Издательство "Грааль", 2003-50с.