Тест-система на основі імуноферментного аналізу для прижиттєвої діагностики трихінельозу свиней

Тест-система на основі імуноферментного аналізу для прижиттєвої діагностики трихінельозу свиней, яка включає імуноферментний аналіз з використанням екскреторно-секреторного трихшельозного антигену, яка відрізняється тим, що при проведенні імуноферментного аналізу для виявлення захворювання використовують екскреторно-секреторний антиген, який концентрують та очищають методом адсорбційної хроматографії на макропористому сорбенті з діаметром пор 8000 А та гель-хроматографм на макропористому сорбенті, модифікованому полівшілпіролідоном з діаметром пор 2000 А Винахід відноситься до ветеринарної медицини, а саме до лабораторної діагностики і призначений для прижиттєвої діагностики трихінельозу свиней Аналог винаходу - близьким технічним рішенням винаходу є реакція мікропреціпітацм на живих личинках трихінел Принцип реакції заключається в тому, що живі личинки чи статевозрілі трихінели, які вміщені в гомологічну імунну сироватку, при температурі 37-40°С виділяють продукти ЖИТТЄДІЯЛЬНОСТІ (секрети і екскрети), котрі преципітуються антитілами імунної сироватки, створюючи преципітати, які чітко видно під мікроскопом Негативна сторона методу заключається в тому, що в реакції використовують живих личинок або статевозрілих трихінел, які можуть бути небезпечними для виконавців реакції, трудомісткість їх одержання та зберігання, недостатня специфічність, ефективність та візуальний облік реакції (1) Прототип винаходу є реакція ензимом мічених антитіл для діагностики трихінельозу Принципова схема відтворення цієї реакції полягає в тому, що в лунки мікропланшета для імунологічних досліджень одноразового використання, які виконують роль інертного носія антигену і антитіл, послідовно вносяться розчинний антиген, дослідна сироватка крові з припустимою наявністю антитіл, кон'югат і субстрат Кон'югат це розчин антивидових антитіл, мічених ферментом пероксидазою хріну, субстрат суміш 0,08%-ий 5-амшосаліцюювоі кислоти з 0,05%-ого перекису водню у відношенні 9 1 В якості антигену використовується трихінельоз ний фракціонований антиген, що готується із свіжоодержаних або люфілізованих личинок трихінел Антиген одержують в 2 етапи, спочатку готується цільний екстракт личинок трихінел, потім він фракціонується методом гель-хроматографм на сефадексі G-200, Створений в процесі постановки реакції комплекс антиген-антитіло виявляється за допомогою кон'югата, що розщеплює субстрат, який характеризується появою темно-коричневого забарвлення, яке може реєструватись візуально по титру дослідних сироваток або за допомогою спектрофотометра , шляхом вимірювання оптичної ЩІЛЬНОСТІ субстрату (2) Описані етапи одержання компонентів для постановки реакції ензимом мічених антитіл, особливо трихшельозного антигену за двома етапами, досить трудомісткі і складні, крім того при використанні фракціонованого антигену при постановці реакції зустрічаються помилково-позитивні результати, реакція недостатньо специфічна, що значно знижує ЦІННІСТЬ реакції ензимом мічених антитіл при діагностиці трихінельозу В основу винаходу поставлено завдання Розробити тест-систему на основі імуноферментного аналізу (ІФА) для прижиттєвої діагностики трихінельозу свиней більше ефективну і простішу при одержанні компонентів для постановки реакції, усунувши недоліки прототипу Тест-система на основі імуноферментного аналізу, представляє собою набір реагентів для (О ю ю 55269 виявлення антитіл з використанням високо специфічного, очищеного, концентрованого екскреторно-секреторного трихшельозного антигену Активними компонентами тест-системи являються трихшельозний антиген іммобілізований в лунках планшет, кон'югат антивидових антитіл, мічених ферментом пероксидазою хріну, контрольні позитивні та негативні сироватки Метод виявлення антитіл до антигенів трихінел представляє собою твердофазний імуноферментний аналіз (ІФА), в ході якого при взаємодії дослідних зразків сироватки крові з іммобілізованими в лунках планшетів антигенами трихінел відбувається зв'язування специфічних антитіл та утворення комплексу антиген-антитіло на поверхні лунок Після відмивання незв'язаних компонентів сироватки і додаванням в лунки мікропланшету кон'югату антивидових антитіл з пероксидазою відбувається включення ферментної мітки в імунний комплекс В результаті ферментативної реакції, що відбулася в лунках (відмитих від надмірного кон'югату) з субстратним розчином для пероксидази, що містять перекис водню і 5% аміносаліцилову кислоту, утворюється забарвлений продукт Інтенсивність забарвлення цього продукту пропорційна концентрації антитіл до антигенів трихінел в дослідному зразку сироватки реакція При обліку реакції ІФА на спектрофотометрі показник оптичної ЩІЛЬНОСТІ вище 0,15 - реакція позитивна Діагностичний титр 1 100 Проведені нами дослідження показали, що кращі результати при постановці реакції ІФА по виявленню антитіл до збудника трихінельозу одержані при використанні екскреторно-секреторного трихшельозного антигену Екскреторно-секреторний трихшельозний антиген одержували шляхом інкубації личинок Trichinella spiralhs Живих швазованих личинок Т spiralhs відмивали в стерильному фізіологічному розчині, потім в розчині Хенкса з додаванням ЮОООД/мл пеніциліну і 1мг/мл стрептоміцину Після чого личинки вміщували в пробірку з середовищем Ігла з додаванням 20мкл/мл 1,5%-ного розчину L-глютамшу і 2мкг/мл 4%-ного розчину гентаміцину Інкубували в термостаті при t 37°C протягом 4 діб Після ЦЬОГО ДЛЯ підвищення активності та специфічності одержані трихшельозні антигени концентрували та очищали методом адсорбційної хроматографії на макропористому сорбенті з діаметром пор 8000 А та гельхроматографм на макропористому сорбенті модифікованому полівітлпіролідоном з діаметром пор 2000 А Постановка реакції виявлення антитіл до збудника трихінельозу методом ІФА В лунки сенсибілізованих трихшельозним антигеном мікропланшет вноситься по 0,1см3 фізіологічний розчин твіну (ФРТ) В першу лунку ряду "А" вноситься 0 1см3 специфічної до трихінельозу сироватки крові В першу лунку ряду "В" вноситься 0,1см3 сироватки крові негативної, а в перші лунки рядів C,D,E,F,G,H вносяться по 0,1см3 ДОСЛІДНІ сироватки і шляхом подвійних розведень розтитровуються всі проби, ретельно перемішуючи їх протягом 5-7 секунд Після цього накрити мікропланшету кришкою і помістити в термостат на 1 годину при температурі +37,5°С Після інкубації вміст лунок злити, заповнити їх ФРТ і знову злити, повторюючи це 6-7 разів У ВІДМИТІ лунки мікропланшети вноситься по 3 0,1см кон'югат антисвинячий, шкубується 1 годину в термостаті + 37,5°С, з наступним ретельним відмиванням мікропланшети 6-7 разів ФРТ та дистильованою водою До всіх лунок мікропланшети вноситься по 0,1см3 розчин субстратної суміші і ведеться спостереження за забарвленням ферментативної реакції При досягненні забарвлення позитивного контролю реакцію зупиняють додаванням до кожної лунки по 30-35мкл 1N HCL і проводиться облік реакції Облік результатів ферментативної реакції проводять за допомогою автоматичного спектрофотометру, або візуально з врахуванням інтенсивності забарвлення за 4-х хрестовою системою ++++ - (яскраво-жовте забарв- - позитивна лення) реакція, +++ - (жовте забарвлення) - позитивна реакція, ++ - (слабо-жовте забарв- - сумнівна лення) реакція, - (забарвлення відсутнє) - негативна Одержаний таким чином антиген використовували для прижиттєвої діагностики трихінельозу методом ІФА У ВІДПОВІДНОСТІ до наказу головного державного інспектора ветеринарної медицини України №1 від 10 01 1997р КОМІСІЄЮ проведена міжвідомча комісійна перевірка "Набору прижиттєвої діагностики трихінельозу методом імуноферментного аналізу (ІФА)" до складу якого увійшов одержаний нами екскреторно-секреторний антиген Результати міжвідомчої комісії перевірки набору діагностиків для ІФА для прижиттєвої діагностики трихінельозу показали 100% чутливість та специфічність Виробничі дослідження по вивченню ефективності діагностичної тест-системи ІФА для прижиттєвої діагностики трихінельозу проводили в Кіровоградській, Миколаївській, Хмельницькій, Одеській та Закарпатській областях В Миколаївській області було досліджено 585 проб сироватки крові, з них в Новобужському районі (КСП"Нива") позитивних виявили 292 гол , в Кіровоградській області досліджено 193 сироватки крові, із них виявили 19 проб позитивних на трихінельоз Всього в реакції імуноферментного аналізу було досліджено 1723 проби сироваток крові свиней При цьому виявили 340 позитивних проб у ІФА з розробленим набором Компоненти набору Тест-системи для прижиттєвої діагностики трихінельозу перевірялась на специфічність та стабільність з гетеролопчними сироватками від хворих свиней на ехінококоз, аскаридоз, саркоцистоз та імунними сироватками проти класичної чуми свиней, ентеровірусний гастроентерит свиней (ЕВГС), трансмісивний гастроентерит свиней ЛТС), хвороби Тешена та бешихи свиней При цьому одержані стабільні негативні результати Таким чином, розроблена тест-система для 5 55269 6 прижиттєвоїдіагностики трихінельозу методом Використана література імуноферментного аналізу з використанням екс1 Бессонов А С Диагностика трихинеллеза креторно-секреторного трихшельозного антигену, Вильнюс, "Минтис", 1975, -с 383 одержаного по методиці розробленій лабораторі2 Белозеров С Н Гуданавичус Т Н Реакция єю діагностики, дає можливість уникнути неспеензимом меченых антител для диагностики трихицифічних позитивних реакцій, підвищити діагноснеллеза Ж "Ветеринария", 1982, Изд "Колос" М тичну ЦІННІСТЬ компонентів набору та спростити їх С 41-44 одержання Підписано до друку 03 04 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24