Спосіб оцінки функціонального стану нейтрофілів крові

Спосіб відноситься до галузі медицини, а саме, до лабораторної діагностики. Може бути використаний у пульмонології, кардіології, онкології, акушерстві та гінекології, гнійній хірургії, травматології, при інфекційних захворюваннях - для діагностики станів ускладнень, загрозливих розвитком системної запальної реакції. Відомий спосіб непрямої оцінки функціонального стану нейтрофілів крові при запальних захворюваннях бронхолегеневої системи [Патент Росии 2138809, заявка 97119387/14/ И.А. Волчегорский, Э.Г., Волкова, Г.Л. Игнатова, О.Л. Колесников. Заявлено 1997.11.12, Опубл. 1999.09.27], який включає збір конденсату повітря, що видихається, визначення в ньому розчинних в ізопрапанолі продуктів перекисного окислення ліпідів, розрахунок індексу окислення ліпідів і непряму оцінку функціонального стану циркулюючих нейтрофілів за допомогою емпірично встановлених рівнянь. Теоретичною основою способу є той факт, що функціонально активні нейтрофіли продукують активні форми кисню, які ініціюють перекисне окислення ліпідів. Недоліком даного способу є неможливість безпосереднього визначення метаболічного статусу нейтрофілів. Крім цього, цей спосіб не враховує внесок в інтенсивність перекисного окислення ліпідів активних форм кисню, що генеруються макрофагами бронхолегеневої тканини. Ознаками, спільними з рішенням, що заявляється, є використання здатності активних нейтрофілів генерувати активні форми кисню, математичний розрахунок інтегрального показника та оцінка функціонального стану нейтрофілів крові за його значенням. Відомий спосіб оцінки функціонального стану нейтрофілів крові на основі дослідження спонтанного та індукованого кісеньзалежного метаболізму клітин [Патент Росии 2218567, заявка 2001132646/14, приор. 2001.12.05., М.А Рачков, В. Ю. Зинкин; Опубл. 2003.12.10], що включає забір венозної крові, виділення нейтрофілів шляхом центрифугування в подвійному градієнті щільності фікол-верографину, гіпотонічний лізис еритроцитів, постановку реакції відновлення нітросинього тетрозолію в діформазан в умовах інкубації нейтрофілів з і без індуктора активації клітин опсонованим і не опсонованим зімозаном, розчинення гранул діформазану дімексидом, оцінку результатів реакції за допомогою фотометрії, визначення коефіцієнта активації по відношенню індукованого рівня клітинної активності до спонтанного рівня активності, оцінку функціонального стану нейтрофілів за відновною здатністю виділених клітин. Недоліками цього способу є тривалість процедури його виконання, необхідність великого об'єму крові, виділення нейтрофілів в умовах, які неодмінно впливають на їх функціональний стан, наявність в лабораторії лікаря-лаборанта імунолога. Ознаками, спільними з рішеннями, що заявляється, є: забір крові, математичний розрахунок інтегрального показника, оцінка функціонального стану нейтрофілів за метаболічною активністю. Відомий спосіб оцінки функціонального стану нейтрофілів за рівнем мієлопероксидази в сироватці крові [Klebanoff S.J. Myeloperoxidase: friend and foe// J. Leukoc. Biol. - 2005.- Vol.77.- P.598-625], що включає забір венозної крові, отримання сироватки крові, визначення в ній рівня мієлопероксидази за допомогою тест-системи зі специфічними до ферменту антитілами, оцінку функціонального стану нейтрофілів за рівнем активності мієлопероксидази в сироватці крові. Недоліком способу в наших умовах є потреба у венозній крові, тривалість його здійснення, використання зарубіжних тест-систем, наявність спеціального устаткування для проведення імуноферментного аналізу і, як наслідок, дорожнеча і недоступність способу для широкого застосування. Спільними з найближчим аналогом ознаками є: забір крові, визначення активності мієлопероксидази, оцінка функціонального стану нейтрофілів по значенню активності в них мієлопероксидази крові. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб оцінки функціонального стану нейтрофілів крові, який шляхом визначення активності мієлопероксидази азурофільних гранул у нейтрофілах мазка крові, дозволяє здійснити експрес - оцінку, понизити вартість аналізу. Спосіб включає реєстрацію статі та віку обстежуваного, забір крові, приготування мазка, фіксацію мазка формаліном, промивання його проточною водою, нанесення на мазок розчину перекису водню та бензидину, інкубацію при кімнатній температурі, промивання мазка дистильованою водою, дофарбування мазка барвником Романовського - Гимза, висушування на повітрі, визначення активності мієлопероксидази в гранулах нейтрофілів за допомогою мікроскопа, математичний розрахунок інтегрального показника - діагностичного індексу d, за формулою: d=1,464+0,002´X1-0,001´Х2-0,006´Х3 , Де d - діагностичний індекс в у.о.; Х1 - активність мієлопероксидази в у.о.,; Х2 - стать ( дорівнює: 1- для чоловіків, 2 - для жінок); Х3 - вік хворого - кількість повних років, та оцінку функціонального стану клітин за його значенням. Відмінними від найближчого аналогу ознаками є: реєстрація статі та віку обстежуваного, приготування мазка, фіксація мазка формаліном, промивання його проточною водою, нанесення на мазок розчину перекису водню і бензидину, інкубація при кімнатній температурі, промивання мазка дистильованою водою, дофарбування мазка барвником Романовського-Гимза, висушування на повітрі, визначення активності мієлопероксидази в гранулах нейтрофілів за допомогою мікроскопа, математичний розрахунок інтегрального показника - діагностичного індексу d, оцінка функціонального стану клітин за його значенням. Відомий спосіб визначення активності мієлопероксидази клітин кісткового мозку при діагностиці гострого лейкозу [Руководство к практическим занятиям по клинической лабораторной диагностике // Под ред. М.А. Базарновой, В.Т. Морозовой. - Киев. - Вища школа.-1998.- С.38-41], що включає взяття пунктату кісткового мозку, приготування мазка, фіксацію мазка формаліном, промивання проточною водою, висушування на повітрі, нанесення на мазок розчину перекису водню і бензидину, визначення активності ферменту в бластних клітинах кісткового мозку. При гострому мієлобластному лейкозі активність ферменту в п ухлинних клітинах - бластах варіює від слабкої до вираженої, залежно від ступеня диференціювання бластів. У нормі нейтрофіли циркулюють у крові в неактивному стані. При дифузії в кров системних цитокинів (патологічні стани) нейтрофіли активуються. Активація клітин супроводжується секрецією вмісту азурофільних гранул. Основний фермент цього типу гранул -мієлопероксидаза. Частина ферменту міцно пов'язана зі структурами гранул, частина - секретується активованими нейтрофілами. Як наслідок, рівень активності ферменту в сироватці крові збільшується, а в нейтрофілах - знижується. Мієлопероксидаза генерує активні форми кисню, що ініціюють перекисне окислення ліпідів мембран клітин. Підвищена функціональна активність нейтрофілів у периферичній крові - показник системної запальної реакції, яка критично небезпечна для життя і вимагає від клініциста негайної фармакологічної корекції. Запропонований спосіб дозволяє швидко і з високою чутливістю виявити залишкову активність мієлопероксидази та оцінити таким чином функціональний стан нейтрофілів і при їх активації провести невідкладну медикаментозну терапію, оцінити її ефективність шляхом дослідження активності ферменту в нейтрофілах у динаміці. Проте зниження активності мієлопероксидази в нейтрофілах крові як маркера ускладнення таких патологічних станів, як інфаркт міокарду, опіки, обмороження, інфекційні захворювання, легенева патологія, ниркова патологія та інші, раніш не використовувалось. Спосіб здійснюють таким чином: реєструють стать та вік обстежуваного, проводять забір (венозної або капілярної) крові для приготування мазка, фіксують його 4% формаліново-спиртовим розчином протягом ~ 30с, промивають у проточній воді, висушують на повітрі, заливають на 5 хвилин свіжоприготованим розчином (2-3 мг бензидину в 6 мл 96% спирту, 4,0 мл дистильованої води, і 0,02 мл 3% перекису водню) для виявлення активності мієлопероксидази, ретельно промивають дистильованою водою, дофарбовують мазок барвником Романовського-Гимза, висушують на повітрі, за допомогою світлового мікроскопа в 100 нейтрофілах оцінюють активність мієлопероксидази (жовтувато-коричневі гранули в цитоплазмі клітин) [Цитохимические исследования лейкоцитов. Лаборатория. Web-ресурс для специалистов по клинической лабораторной диагностике: www.primer.ru/manuals/cytology/cytochem.htm#grekhem], а як інтегральний показник використовують діагностичний індекс d (канонічна дискримінанти функція), величину якого розраховують за формулою: d=1,464+0,002´X1-0,001´Х2-0,006´Х3, де : d - діагностичний індекс в у.о.; Х1 - активність мієлопероксидази (аМПО) в у.о., яку розраховують відповідно до формули Астальді - Верга: аМПО = a3+b2+c1+d, де: аМПО - активність мієлопероксидази в у.о.; а – число нейтрофілів з нульовою активністю – відсутність забарвлених гранул у цитоплазмі; b - число клітин зі слабопозитивною активністю - одиничні гранули; с - число клітин з позитивною активністю - гранули займають 50% цитоплазми; d - число клітин з різко позитивною реакцією - більше половини цитоплазми зайнята гранулами; Х2 - стать (дорівнює: 1- для чоловіків, 2 - для жінок); Х3 - вік хворого - кількість повних років, і проводять оцінку функціонального стану нейтрофілів крові за його значенням. При значенні індексу d1,7, що виключає наявність активації нейтрофілів крові. Запропонований спосіб дозволяє оцінювати ефективність патогенетичної терапії попередження розвитку системної запальної реакції або розвитку системної запальної реакції у зв'язку з коротким періодом напівжиття циркулюючих нейтрофілів і щохвилинним оновленням значної частини їх п улу.