Спосіб оцінки функціонального стану базофільних гранулоцитів крові у хворих на бронхіальну астму

Спосіб оцінки функціонального стану базофільних гранулоцитів крові у хворих на Винахід відноситься до галузі медицини, а саме, імунологи і пульмонології і може бути застосований для оцінки функціонального стану ефекторних клітин (базофільних гранулоцитів крові) у хворих на бронхіальну астму (БА) з метою визначення ефективності проведеної терапії Згідно З визначенням бронхіальної астми запропонованому на міжнародній ДОПОВІДІ про БА прийнятому у 1992 році, (див Чучалин А Г Бронхиальная астма - М Агар, 1997 - 424с), БА - це генетичне детерміноване захворювання дихальних шляхів, яке вирізняється наявністю оберненої обтураци бронхів, наявністю алергічного процесу в слизових оболонках бронхів, чутливістю бронхіального дерева до різних факторів середовища - пперреактивністю бронхів З цього визначення витікають два особливі моменти, по перше БА це хронічний процес, а не епізодичний, а по друге - астму виділяють як захворювання, яке має алергічну запальну природу з наявністю клітинних інфільтратів в бронхах, а саме еозинофілів, тканевих базофілів та лімфоцитів Значну роль в вищевказаних процесах відіграють базофільні гранулоцити, оскільки однією з ознак запалення при БА є відображення різноманітних комбінацій ефектів базофільних гранулоцитів, які знаходяться в різних функціональних станах, та їх медіаторів Під функціональним станом базофільних гранулоцитів (БФ) розуміють здатність БФ відповідати видається під відповідальність власника патенту ГРАНУЛОЦИТІВ КРОВІ У ХВОРИХ бронхіальну астму шляхом проведення прямої дегрануляцм базофільних гранулоцитів крові, який відрізняється тим, що визначають відсоток спонтанно дегранулюючих та активованих алергенами клітин, а також різницю між ними, за різницею між кожним з цих показників та показниками дегрануляцм у здорових осіб оцінюють функціональний стан базофільних гранулоцитів крові як нормальний, якщо показники коливаються в межах від 0 до 5 %, позитивний - при наявності більш ніж 5 % дегранулюючих клітин на специфічний подразник процесом синтезу та виділення медіаторів (екзоцитоз) (див Чучалин А Г Бронхиальная астма - М Агар, 1997 - 424с ) Повсякденні алергени в нашому житті є каталізаторами для запуску механізмів виділення медіаторів, що в комплексі призводить у хворих на БА до бронхообструкци, зумовленої спазмом гладких м'язів бронхів, набряком бронхіальної стінки, та пперсекрецією бронхіальних залоз Відомий спосіб оцінки функціонального стану базофільних гранулоцитів крові у хворих на бронхіальну астму шляхом проведення прямої дегрануляцм базофільних гранулоцитів крові з визначенням КІЛЬКОСТІ виділеного гістаміну з застосуванням збагаченої базофілами завісі мононуклеарних клітин (див Р Stachl Skov, S Norn // ActaAllergol -1977 - Vol 32 -P 170-182) Спосіб полягає в тому, що після виділення завісі мононуклеарних клітин збагачених БФ и фасують у пластикові пробірки по 400мкл з розрахунку по 2000 8000 БФ на пробу Пробірки шкубують при 37°С протягом 40 хвилин з 50мкл препарату, який досліджується Реакцію зупиняють, пробірки центрифугують, надосад з гістаміном та білком, який не дає змоги визначити виділений гістамін, виливають, та в осаді визначають гістамін, використовуючи високочутливий спектрофлюориметр Виділення гістаміну вираховують у відсотках до КІЛЬКОСТІ КЛІТИН В порції Поправка на спонтанне виділення гістаміну складає 1 -10% ю ю 55201 Однак цей спосіб має такі недоліки по перше, спосіб недостатньо інформативний, оскільки функціональний стан базофільних гранулоцитів оцінюють тільки за одним показником КІЛЬКОСТІ виділеного гістаміну, при цьому невідомо яка частка гістаміну виливається з надосадом та які ще медіатори виділились з клітини, по друге - значна тривалість дослідження (4,5 години), бо в кожній пробі необхідно підрахувати КІЛЬКІСТЬ БФ, що подовжує термін реакції в одній пробі на 10 - 15хв, та застосувати специфічне забарвлення гістаміну ортофталевим альдегідом, що подовжує термін реакції ще на 25 хвилин, по третє, даний спосіб вимагає наявності спеціального коштовного обладнання В основу винаходу поставлена задача удосконалити спосіб оцінки функціонального стану базофільних гранулоцитів крові у хворих на бронхіальну астму, в якому шляхом визначення відсотку дегранулюючих клітин з врахуванням спонтанної та активованої алергенами дегрануляцм досягається підвищення інформативності та скорочення терміну дослідження Поставлена завдання вирішується тим, що у способі оцінки функціонального стану базофільних гранулоцитів крові у хворих на бронхіальну астму шляхом проведення прямої дегрануляцм базофільних гранулоцитів, згідно з винаходом визначають відсоток спонтанно дегранулюючих клітин та активованих алергенами та за різницею між ними, а також за різницею між кожним з цих показників та показниками дегрануляцм у здорових осіб оцінюють функціональний стан базофільних гранулоцитів крові як нормальний, якщо показники коливаються в межах від 0 до 5%, позитивний - при наявності більш ніж 5% дегранулюючих клітин Під нашим наглядом знаходилось 50 пацієнтів, ЗО з яких - хворі на БА, і 20 - здорові особи При обстеженні хворих на БА було відмічено підвищення спонтанної дегрануляцм (СП) базофілів на 5 - 10% від норми, яка становила 25,20 ± 4,80% Це, ймовірніше, пояснюється тим, що частота рецепторних взаємодій, яка призводить до виділення медіаторів, підвищується, що призводить до нестабільності мембрани БФ Це в свою чергу веде за собою підвищену реакцію цих клітин на подразник У даному випадку ми застосували побутові та пилкові алергени, які трапляються нам на кожному кроці Відсоток дегранулюючих клітин після активації виріс на 10 - 30% відносно норми та на 5 - 20% відносно показника спонтанної дегрануляцм БФ, що є показниками чутливості хворого до застосованого подразника Таким чином, за різницею між показниками спонтанної та активованої дегрануляцм, а також за різницею між кожним з цих показників та показниками дегрануляцм у здорових осіб оцінюють функціональний стан базофільних гранулоцитів крові як нормальний, якщо показники коливаються в межах від 0 до 5%, позитивний - при наявності більш ніж 5% дегранулюючих клітин Спосіб здійснюють таким чином Для приготування завісі мононуклеарних клітин збагачених базофільними гранулоцитами, з вени беруть Юмл крові та виливають у пробірку, яка містить 0,5мл 0,2М розчину ЕДТА (етилдіамінотетраоцтова кислота) рН - 7,2, добре перемішу ють, та додають 22,5мл 0,9% розчину хлористого натрію Базофільні гранулоцити виділяють за методом Дей Р (див Р StachlSkov, S Norn // Acta Allergol 1977 - Vol 32 - P 170 - 182), тобто Юмл суміші фікола і верографіну ЩІЛЬНІСТЮ 1,080Г/Л при 20°С, вносять під шар крові та центрифугують при 400д протягом 40 хвилин Інтерфазу з БФ переносять в пластикову пробірку з 15мл розчину трисА(трис\пдроксилметил\амшометан 25мМ при рН 7,6, NaCI - 0 12М, КСІ - 5мМ, сироватковий альбумін людини 0,Змг/мл, глюкоза 1мг/мл), завісь центрифугують при 107д протягом 10 хвилин при 4°С Осад змішують з Юмл розчину трис-А Завісь центрифугують при 60д протягом 10 хвилин при 4°С Осад ресуспендують в Юмл розчину трисАМС(трис-А, 1,15мМ МдСІ2 і 0 6мМ СаСІ2) Завісь БФ фасують в пробірки по 400мкл на пробу Після ЧОГО ОЦІНЮЮТЬ спонтанну дегрануляцію Бф Для цього беруть 400мкл завісі БФ, яка містить від 2000 до 8000 базофілів інкубують в пластикових пробірках при 37°С протягом 40 хвилин з 50мкл трис-АМС Реакцію зупиняють Змл охолодженого розчину трис-АМС Пробірки з клітинами центрифугують при 2000д протягом 10 хвилин при 4°С Надосад з часткою гістаміну та білку виливають Активацію БФ побутовими та пилковими алергенами проводять наступним чином 400мкл завісі БФ, яка містить від 2000 до 8000 базофілів інкубують в пластикових пробірках при 37°С протягом 40 хвилин з 50мкл екстракту специфічного алергену в концентрації 1000 одиниць Реакцію зупиняють Змл охолодженого розчину трис-АМС Пробірки з клітинами центрифугують при 2000д протягом 10 хвилин при 4°С Надосад з часткою гістаміну та білку виливають Після ЧОГО проводять підрахування відсотку спонтанно дегранулюючих клітин БФ (ДБГ СП) та відсотку дегранулюючих клітин активованих алергенами хатнього пилу (ДБГ Хп), бібліотечного пилу (ДБГ Бп), рослинного пилку (ДБГ Рмікст), яке здійснюють таким чином 40мкл завісі БФ переносять на пофарбовані 0,3% розчином нейтраль-рот на абсолютному спирті скельця, закривають покривним склом, та вираховують відсоток дегранулюючих клітин від загальної КІЛЬКОСТІ БФ під мікроскопом За різницею між показниками спонтанної та активованої дегрануляцм а також за різницею між кожним з цих показників та показниками дегрануляцм у здорових осіб оцінюють функціональний стан базофільних гранулоцитів крові як нормальний, якщо показники коливаються в межах від 0 до 5%, позитивний - при наявності більш ніж 5 % дегранулюючих клітин Конкретні приклади здійснення способу Приклад 1 (за способом прототипом) Хвора Ф , 21 рік, історія хвороби №550 Знаходилась на лікуванні у відділенні бронхіальної астми Інституту фтизіатрії і пульмонології АМНУ з приводу БА у фазі загострення При імунологічному дослідженні БФ під впливом пилкового алергену виділення гістаміну становило 42,9%, а після лікування препаратом Інтал фірми "Fisons", Англія, інгаляційно 200мг на добу, протягом 14 діб, виділення гістаміну становило - 33,2%, але помилка методу становить 10%, тому зміна функціонально 55201 го стану БФ після лікування, оцінена за цим методом, не є достовірною, та ефективність лікування за отриманими результатами викликає сумнів Приклад 2 (за способом, який заявляється) Хвора Л , 36 років Історія хвороби №2074 Знаходилась на лікуванні у відділенні бронхіальної астми Інституту фтизіатрії і пульмонології АМНУ з приводу БА у фазі загострення При імунологічному дослідженні БФ було виявлено різке підвищення спонтанної дегрануляцм базофілів до 40%, активованої рослинним пилком - 45%, хатнім пилом 60%, бібліотечним пилом - 39,7%, що значно вище норми на 10, 15, ЗО, і 9,7% ВІДПОВІДНО 3 отриманих даних видно, що стан мембрани ефекторних клітин нестабільний, з підвищеним виділенням медіаторів навіть за рахунок спонтанної дегрануляцм БФ (на 10%), та високою чутливістю ефекторних клітин на такі повсякденні подразники як хатній пил (на 20%) і рослинний пилок (на 5%) відносно показника спонтанної дегрануляцм БФ Хворій було проведене лікування препаратом Інтал фірми "Fisons", Англія, інгаляційно 200мг на добу, протягом 14 діб При повторному імунологічному обстеженні рівень спонтанної дегрануляцм БФ знизився до 20%, активованої рослинним пилком до 31%, хатнім пилом до 27%, що відповідає нормальному значенню цих показників у здорової людини, тому що різниця між ними, а також за різниця між кожним з цих показників та показниками дегрануляцм у здорових осіб коливається в межах від 0 до 5% Це свідчить про те, що мембрана БФ під дією препарату стабілізувалась, що в свою чергу свідчить про нормалізацію функціональної активності БФ, а стан пацієнта змінився на кращий Таким чином зниження відсотку дегранулюючих клітин до норми є критерієм ефективності лікування Приклад 3 (за способом, який заявляється) Хвора К, 38 років Історія хвороби №1544 Знаходилась на лікуванні у відділенні бронхіальної астми Інституту фтизіатрії і пульмонології АМНУ з приводу БА у фазі ремісії При імунологічному дослідженні БФ не було виявлено підвищення спонтанної дегрануляцм базофілів, яка становила 27%, активованої рослинним пилком - 33%, хатнім пилом - 35%, бібліотечним пилом - 32%, що вище норми в межах від 0 до 5% (на 3, 3, 5, і 2% ВІДПОВІДНО) 3 отриманих даних видно, що стан мембрани ефекторних клітин стабільний, з незначним підвищеним виділенням медіаторів навіть за рахунок незначної чутливості ефекторних клітин на такі повсякденні подразники як хатній пил (на 8%) і рослинний пилок (на 6%) відносно показника спонтанної дегрануляцм БФ Виходячи з цих показників хворій було проведене традиційне лікування При повторному імунологічному обстеженні рівень спонтанної дегрануляцм БФ знизився до 22%, активованої рослинним пилком до 22%, хатнім пилом до 27%, що відповідає нормальному значенню цих показників у здорової людини, тому що різниця між ними, а також різниця між кожним з цих показників та показниками дегрануляцм у здорових осіб коливається в межах від 0 до 5% Це свідчить про те, що мембрана БФ під дією традиційної терапії ще більш стабілізувалась, що в свою чергу свідчить про нормалізацію функціональної активності БФ, а стан пацієнта змінився на кращий Таким чином зниження відсотку дегранулюючих клітин до норми є не тільки критерієм ефективності лікування але й критерієм призначення необхідного виду терапії Запропонований спосіб був застосований у ЗО хворих, що складали основну групу У всіх хворих на БА на початку лікування була виявлена нестабільність мембран БФ та підвищена чутливість на побутові та пилкові подразники Після проведеної терапії препаратами Інтал та Тайлед (виробництва фірми "Fisons", Англія) у всіх хворих визначалась позитивна динаміка, а при імунологічному обстеженні відзначалась стабілізація мембран БФ, що свідчило про нормалізацію функціонального стану цих клітин (див табл 1) Таблиця 1 Динаміка показників функціонального стану базофільних гранулоцитів крові у хворих на БА Показники п ДГБСП ДГБ Рміхт ДГБХп ДГББп Примітки Здорові особи 20 25,20 ± 4,8 25,20 ± 4,8 25,20 ± 4,8 25,20 ± 4,8 Хворі на БА до лікування ЗО 35,52 ±2,11 36,49 ±1,81 38,10 ±2,77 36,90 ± 2,09 Після лікування Препарат „Інтал" Препарат „Тайлед" 10 20 20,54 ±1,48* 35,52 ±2,11* 36,49 ±1,81* 21,64 ±1,14* 22,54 ±1,23* 38,10 ±2,77* 19,73 ±1,52* 36,90 ± 2,09* - достовірна ВІДМІННІСТЬ до та після лікування (р < 0,05) Контрольну групу складали 20 хворих на БА, яким проводилось імунологічне дослідження функціонального стану БФ за способом прототипом до та після проведеного курсу лікування препаратом Інтал (виробництва фірми "Fisons", Англія) Виділення гістаміну становило до лікування Рмікст 48,9 ± 5,6%, від загальної КІЛЬКОСТІ медіатору, після лікування Рмікст - 37,2 ± 4,8% від загальної КІЛЬКОСТІ медіатору Помилка методу становить близько 10% тому достовірність змін цього показника викликає сумнів, ж і оцінка ефективності проведеного лікування за цим показником Таким чином, у порівнянні з прототипом, запропонований нами спосіб оцінки функціонального стану БФ крові у хворих на БА шляхом визначення відсотку дегранулюючих клітин, як спонтанних так і активованих алергенами та за різницею між ними, а також за різницею між кожним з цих показників 55201 та показниками дегрануляцм у здорових осіб оцінюють функціональний стан мембрани БФ в динаміці лікування Спосіб дає змогу оцінити виділення з ефекторних клітин (базофільних гранулоцитів) не тільки гістаміну, але й інших медіаторів запалення, за рахунок чим досягається підвищення інформативності способу, та скорочення терміну дослідження з 4,5 годин до 3-х годин Цей показник можна вважати критерієм ефективності лікування цієї 8 категорії хворих Запропонований спосіб визначення функціонального стану базофільних гранулоцитів у хворих на бронхіальну астму методично простіший за прототип, доступний, дешевий, і може бути рекомендований для застосування у будь якій лабораторії імунологи Він не потребує коштовних реактивів та обладнання Підписано до друку 03 04 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24