Лікарська форма протипухлинного препарату та спосіб її одержання

Винахід відноситься до фармакології, а саме до лікарських форм протипухлинних препаратів, що містять похідну платини з дезоксирібонуклеїновою кислотою, а також фторурацил, та способам їх одержання. Такі препарати можуть бути використані для лікування злоякісних новоутворень в термінальних стадіях у формі розчину для внутрішньовенного та внутріпшьоартеріального введення. Відома лікарська форма (ЛФ) протипухлинного препарату похідної платини з поліаніоном дезоксирибонуклеїнової кислоти in situ (Pt-ДНК), яка включає також натрій хлористий, натрій лимоннокислий, амоній хлористий та фторурацил у вигляді натрієвої солі при співвідношенні компонентів в водному розчині, мас.%: Pt-ДНК натрій хлористий натрій лимоннокислий амоній хлористий натрієва сіль фторурацилу [пат. України №23676 А]. 0,130-0,153 0,080-0,090 0,040-0,053 0,015-0,018 0,025-0,370 Як показали дослідження відомої ЛФ, молекули активної субстанції Pt-ДНК в ній мають таку просторову структуру, яка сприяє взаємодії молекул Pt-ДНК в більшій мірі між собою, ніж їх взаємодія з молекулами розчину, і тому молекули Pt-ДНК в розчині утворюють значні асоціати розміром 0,5-1,0мкм в найбільшому вимірі. Таке асоціювання активно діючої речовини викликає зменшення її істинної концентрації і призводить до зменшення протипухлинної активності препарату та зниження його ефективності. Крім того, асоціювання молекул препарату обмежує його використання тільки внутрішньоочеревинним введенням, виключаючи внутрішньовенне та внутрішньоартеріальне, із-за гематотоксичності препарату, яка виникає в результаті адсорбції асоціатів Pt-ДНК еритроцитами крові та стінками кровоносних судин. Слідством такої адсорбції є руйнування еритроцитів та гемоліз. Дрібні капіляри периферичної крові емболізуються і порушується гемодинаміка органів з наступним порушенням їх структури та функцій. Відомий спосіб одержання лікарської форми протипухлинного препарату платини для інфузій шляхом розчинення волокон ДНК в цитратно-сольовому розчині, який містить натрій хлористий, натрій лимоннокислий, шляхом механічного перемішування, наступного нагрівання розчину ДНК до 70-90°С, змішування нагрітого розчину ДНК з нагрітим до такої ж температури цитратно-сольовим розчином цис-дихлородиаммінплатини (ДДП) та термостатування суміші розчинів ДНК та ДДП при 70-90°С протягом 15-20 хвилин з наступним додаванням до суміші термостатованих розчинів водного розчину натрієвої солі фторурацилу (пат. України №23676А). Розчинення волокон ДНК в цитратно-сольовому розчині без застосування технологічної операції, яка забезпечує повне розділення волокон ДНК, і послідовність проведення операцій приготування препарату не запобігають асоціації молекул Pt-ДНК в розчині. Задача винаходу полягає у створенні лікарської форми протипухлинного препарату для інфузій з підвищеною ефективністю та розширеним діапазоном застосування за рахунок використання Pt-ДНК з неасоційованими молекулами. Задача вирішується лікарською формою протипухлинного препарату для інфузій на основі водного розчину похідної платини з поліаніоном дезоксирібонуклеїнової кислоти in situ, яка містить натрій хлористий, натрій лимоннокислий, амоній хлористий та фторурацил у вигляді натрієвої солі при співвідношенні компонентів в водному розчині, мас.%: Pt-ДНК натрій хлористий натрій лимоннокислий амоній хлористий натрієва сіль фторурацилу 0,130-0,153 0,080-0,090 0,040-0,053 0,015-0,018 0,025-0,370 в якій, відповідно до винаходу, використовують Pt-ДНК з неасоційованими молекулами розміром 0,05-0,15мкм в найбільшому вимірі. Ефективні інтервали концентрацій та співвідношення компонентів водного розчину ЛФ, що заявляється, відповідають співвідношенням, встановленим при розробці відомої ЛФ для інфузій внутрішньоочеревинного введення. Розміри молекулярних структур Pt-ДНК у відомій ЛФ та у ЛФ, що заявляється, визначались методом електронної мікроскопії. Задача винаходу також полягає у розробці способу одержання ЛФ для інфузій, який шляхом застосування додаткової операції по розділенню волокон ДНК та зміни послідовності операцій приготування ЛФ, забезпечує одержання ЛФ з неасоційованими макромолекулами Pt-ДНК розміром 0,05-0,15 в найбільшому вимірі, а також забезпечує попередження асоціації молекул Pt-ДНК в ЛФ. Винахід також полягає у способі одержання лікарської форми протипухлинного препарату для інфузій шляхом розчинення волокон ДНК в цитратно-сольовому розчині, який містить натрій хлористий, натрій лимоннокислий, шляхом механічного їх перемішування, нагрівання розчину ДНК до 70-90°С, змішування нагрітого розчину ДНК з нагрітим до такої ж температури цитратно-сольовим розчином цис-дихлородиаммінплатини (ДДП), термостатування суміші розчинів ДНК та ДДП при 70-90°С протягом 15-20 хвилин та додавання до суміші розчинів водного розчину натрієвої солі фторурацилу, в якому, відповідно до винаходу, волокна ДНК перед перемішуванням витримують в цитратно-сольовому розчині протягом 16-26 годин, змішування приготованих розчинів ДНК та ДДП проводять шляхом поступового додавання розчину ДДП до розчину ДНК, а додавання водного розчину натрієвої солі фторурацилу проводять перед термостатуванням суміші. Приклади одержання ЛФ, що заявляється, та її характеристики в залежності від умов одержання наведені в таблиці 1 у порівнянні з прикладом одержання відомої ЛФ та її характеристиками. Таблиця 1. № прикладу 1 2 3 4 Умови одержання ЛФ Характеристика одержаної ЛФ Розмір Температура Кількість вихідних Склад ЛФ, мас.% Втримування нагрівання і молекулярних компонентів, г/л структур PtДНК, год. термостатування, ДНК ДДП NaCl Na3cyt ФУ °С ДНК ДДП NaCl Na3cyt ФУ ДНК, мкм 0,65 0,67 0,72 0,72 0,85 0,88 0,94 0,94 0,87 0,92 0,97 0,97 0,43 0,47 0,53 0,53 4,00 2,00 0,25 4,00 16 22 26 0 70 78 90 80 0,630 0,080 0,142 0,089 0,153 0,093 0,153 0,093 0,040 0,046 0,053 0,053 0,015 0,016 0,018 0,018 0,370 0,192 0,370 0,370 0,05-0,12 0,05-0,13 0,05-0,15 0,5-1,0 Різниця просторової структури Pt-ДНК у відомій та ЛФ, що заявляється, підтверджується різним розміром їх молекулярних структур, який відрізняється один від одного на порядок. Розмір молекулярних структур у ЛФ, що заявляється, відповідає розміру індивідуальних макромолекул речовини, що підтверджує неасоційованість молекул Pt-ДНК у ЛФ. Гематотоксичність ЛФ, що заявляється, досліджували у порівнянні з прототипом та з контролем фізіологічним розчином (0,9% розчин NaCl). Дослідження проводили на семи групах білих безпородних щурів самців вагою 200±20г (по 12 тварин в кожній групі). Тваринам внутрішньовенне, через день, тричі вводили досліджувані препарати, після чого методом кислотних еритрограм аналізували їх периферичну кров. Геметотоксичність оцінювали за кількістю зруйнованих молодих еритроцитів, що виражена у відсотках, через 1 добу та 14 діб після закінчення введення препаратів. Результати досліджень наведені в таблиці 2. Таблиця 2. Група тварин І (контроль) ІІ ІІІ IV V VI VII Препарат, що введений Фізіологічний розчин ЛФ за прикладом №1 ЛФ за прикладом №2 ЛФ за прикладом №3 ЛФ за прикладом №4 Доза Pt-ДНК, мг/кг 5,0 30,0 30,0 30,0 5,0 30,0 Кількість зруйнованих еритроцитів, після введення препаратів, % через 1 добу через 14 діб 2-5 2-3 2-3 2-3 4-5 2-3 2-3 2-3 2-3 1-2 100 16-18 100 38-43 Аналіз даних таблиці 2 показує, що нова ЛФ не має гематотоксичності, тоді як у відомої ЛФ вона виражена суттєво. В крові тварин II-V груп, яким вводили ЛФ, одержану за прикладами №№1-3, кількість зруйнованих еритроцитів, як в близькі, так і в віддалені строки після ін'єкцій, незалежно від дози Pt-ДНК не відрізняється від контролю та складає тільки 1-5%, що відповідає фізіологічній нормі. У тварин VI та VII груп, яким вводили відому ЛФ (приклад №4), через добу руйнуються усі молоді еритроцити. Через 14 діб ступінь вираженності гематотоксичності падає, але залишається на досить високому рівні. Кількість зруйнованих еритроцитів нової генерації залишається вищою за норму і зі збільшенням дози Pt-ДНК збільшується. Протипухлинну активність відомої та ЛФ, що заявляється, оцінювали на основі експериментів, які були проведені на моделі короткострокове культивованих клітин, одержаних у хворого на ангіосаркому головного мозку безпосередньо під час операції. Для культивування використовували поживну суміш стандартного складу: середовище Ігла (40%), ембріональна теляча сироватка (30-40%), глюкоза (800мг.%), інсулін (0,2од/мл). Культури клітин витримували в інкубаторі з постійним режимом газового складу та вологості при 36,7°С. Через 4-5 діб після висівання частину клітин залишали для контролю, а інші обробляли ЛФ, що заявляється, відомою ЛФ та фізіологічним розчином. Термін інкубації культур з кожним препаратом складав 24 години. Протипухлинну активність оцінювали за цитотоксичністю, яку характеризували кількістю загиблих клітин, виражену у відсотках. Результати підрахунків кількості загиблих клітин у культурах наведені в таблиці 3. Таблиця 3 Культура клітин І(контроль) ІІ ІІІ IV V VI VII Препарат Концентрація Pt-ДНК у культурі, мкг/мл фізрозчин ЛФ за прикладом№1 ЛФ за прикладом№2 ЛФ за прикладом№3 ЛФ за прикладом №4 5,0 15,0 30,0 30,0 30,0 30,0 Кількість загиблих клітин, % 0,3 30 61 80 78 83 38 (відома) Дані таблиці 3 свідчать, що при порівняльній кількісній оцінці протипухлинної активності за тестом цитотоксичності, ЛФ,що заявляється, суттєво перевищує відому. При однакових концентраціях похідної платини в культурі - 30мкг/мл, відома ЛФ викликає загибель тільки 38% клітин, в той час як ЛФ, що заявляється, - 80%. ЛФ, що заявляється, була клінічне випробувана на 3-х групах з 37 хворих: І група - 11 хворих з канцероматозом черевної порожнини та асцитом, II група - 7 хворих з метастатичним пухлинним ураженням печінки з частковою резекцією органу, III група - 19 хворих з неоперабельним метастатичним пухлинним ураженням печінки. Хворим усіх трьох груп ЛФ препарату, одержану, як описано у прикладах №1-3, вводили тричі рівними об'ємами по 250мл в сумарній дозі діючої речовини в розрахунку на Pt-ДНК 1,00-1,15г на людину вагою 70кг. Хворим І групи ЛФ вводили внутрішньоочеревинно, II групи - внутрішньовенно, ІІІ групи внутрішньоартеріально ( у печінкову артерію або її окремі гілки). Проведені клінічні дослідження показали, що, як внутрішньоочеревинне так і внутрішньовенне та внутрішньоартеріальне застосування ЛФ, що заявляється, підвищує ефективність хіміотерапії, яка виражається у стабілізації та частковій регресії пухлинного процесу, подовженні міжрецидивного періоду. При цьому у хворих не зафіксовані клінічні та лабораторні проявлення гематотоксичності або будь-які інші побічні явища. У всіх хворих підвищилась активність та поліпшилась якість життя.