Кріопротектор

Изобретение касается криобиологии и может быть использовано при низкотемпературном консервировании биологических объектов, в частности клеток крови, костного мозга и перевива емых клеточных культур. Целью изобретения является повышение степени 1 защиты биологических объектов при их низкотемпературном консервировании с использованием ы-монометилового эфира глицерина (ММЭГ) в качестве криопротектора. Тромбоциты донорской крови помещают в криозащитные среды (в виде 10%-ных растворов в плазме) ММЭГ и глицерина (в качестве сравнения). Замораживание осуществляют со скоростью 10 град/мин до минус 70*С с последующим погружением в жидкий азот. Деконсервирование проводят путем отогрева на водяной бане при 37вС. При использовании в качестве криопротектора ММЭГ сохраняется на 40% больше клеток, чем в случае применения глицерина, при этом их ретрактильная активность на 20% выше. 3 табл. ГРГ 1298203 1 Изобретение относится к криобиоток, чем в случае применения глицерилог ии и может быть использовано при на, при этом их ретрактильная активнизкотемпературном консервировании ность на 20% выше. биологических объектов, в частности П р и м е р 2. Клеточную взвесь клеток крови, костного мозга и перекостного мозга разводят в соотношении 1:1 с ММЭГ и глицерином, приготоввиваемых клеточных культур. ленными на дистиллированной воде до Целью изобретения является повышеконечной концентрации криопротектоние степени защиты биологических объров 5; 7,5; 15%. ектов при их низкотемпературном конКонцентрация клеток, определенная сервировании. 10 в камере Горяева, составляет 2,06 х Эта цель достигается применением х 10 кл/мл. d-монометилового эфира глицерина После 15-минутной эквилибрации (ММЭГ) формулы клеточную взвесь разливают по 1,5 мл сн 2 - сн - снг в полиэтиленовые контейнеры и запаОН он оси. ивают. в качестве криопротектора. Замораживание осуществляют по двух По международной классификации этапной программе: со скоростью 1 (1961 г.) данное соединение имеет на1 град/мин до минус 15°С, выдержка звание З-метокси-1,2-пропандиол. ^ 3 мин при минус 15°С, далее до минус П р и м е р 1 . Тромбоциты выделя80"С со скоростью 10 град/мин с послеют из донорской крови методом диффедующим погружением в жидкий азот. ренцированного центрифугирования.Крио- После 15- сут хранения при азотной защитные среды готовят в вице 10%-ных температуре минус 196 °С отогрев прорастворов глицерина и ММЭГ в плазме. 2$ водят на водяной бане при 40°С до К тромбоконцентрату, содержащему 2 исчезновения твердой фазы. 10 клеток/мл, добавляют медленно Жизнеспособность клеток костного криозащитные растворы в соотношении мозга определяют по методу Шрека. 1:1, так, что конечная концентрация Результаты представлены в табл.2. глицерина и ММЭГ была 5%. 30 Замораживание осуществляют со скоростью 10 град/мин до минус 70 °С с последующим погружением в жидкий азот. Деконсервирование проводят путем отогрева на водяной бане при 37 С. Морфофункциональиые свойства тромбоцитов после размораживания оценивают путем подсчета общего количества клеток в камере Горяева, а также по показателям ретрактильной и агрегационной активности (табл. І ) . . В табл. 2 приведены сравнительные данные по криозащитной активности ММЭГ и глицерина при различной конечной концентрации криопротекторов в расчете на исходную концентрацию клеток 2*10 мл. Т а б л и ц а 2 Конечная концентрация криоКриопротек- протектора, % тор 15 Т а б л и ц а 1 Криопротек 45 ММЭГ Показатели Количество тромбоцитов, % Ретрактильная активность, % Степень агрегации 11400*275 16640*580 57Z Глице рин 4920+150 25% 83% 112201440 56% 18120*500 91% 143001470 71% Иэ табл. 2 видно, что при использовании в качестве криопротектора 5% глицерин 5015 35*3 5*1 55 ММЭГ жизнеспособных клеток на 20-30% больше, чем в случае применения глицерина . Из табл. 1 видно, что при испольРавноценный криозащитный эффект зовании в качестве криопротектора достигаетгя применением более низких ММЭГ сохраняется на 40% больше кле5% ММЭГ 9012 5512 ,8,4 з 1298/4)3 концентраций предлагаемого криопрореч одни сутки яамену среды для удатектора. Так, S07o жизнеспособных кле- ления криопротектора. ток костного мозга после замораживаСохранность клеток оценивают мения можно получить применением 7,5%тодом суправитального окрашивания ным раствором ММЭГ. тогда как такой с 0,2%-ным раствором трипанового синеже эффект сохранности достигается го, а также по динамике и характеру применением 15%-ного раствора глиформирования моноспоя. церина. Концентрация клеток культуры ПТ и их жизнеспособность в суспензии, подСравнительное исследование криозащитной активности глицерина и ММЭГ 10 вергнутой криоконсервации под защитой было проведено на перевиваемой кульглицерина и ММЭГ, приведена в табл.3. туре клеток почки теленка (ПТ). Т а б л и ц а З П р и м е р 3. Сформировавшийся Криопро- Концентрация Жизнеспособмонослой клеток перевиваемой линии почки теленка в хорошем морфологичес- 15 ком состоянии снимают со стекла смекрио- клеток, сью растворов версена и трипсина в про10s соотношении 9:1. Клеточную взвесь * тексобирают в один сосуд, измеряют ее тора, объем, берут пробу для подсчета кон- 20 центрации клеток в камере Горяева. К суспензии клеток в соотношении Глицерин 10 16,2±1,2 74,0+2,2 1:1 при постоянном перемешивании добавляют 20 или 10%-ный раствор ММЭГ или 20%-ный раствор глицерина пита- 25 75,011,4 17,6+0,6 10 тельной среде, содержащей: 0,5%-ный гидролизат лактальбумина на растворе 82,0±1,1 ММЭГ 5 18,0+1,6 Хенкса 45%; среда 199 45%; сыворотка крупного рогатого скота 10%; канамиИз данных, представленных в табл.3, цина сульфат 100 мкг/мл. Концентра- 30 следует, что ММЭГ в меньшей, чем глиция клеток составляет 2,1'10 мл. церин концентрации оказывает более Затем клеточную суспензию разливавыраженный криозащитныи эффект в отют в полиэтиленовые ампулы по 1,5 мл ношении клеток перевиваемой культуры и запаивают. ПТ. 35 По истечении 4 сут культивирования Эквилибрацию клеток с криозащитной монослой клетками был выполнен на средой осуществляют в течение 1,5 ч 100% поверхности культурального сосупри 4°С. Охлаждение проводят в прогда. раммном замораживателе: на первом этаКлетки имеют полигональную форму пе со скоростью 1 град/мин до минус 40 с хорошо выраженными границами, не 30°С, на втором - 5 град/мин до минус теряют способности пассироваться. В 70°С, после чего ампулы с суспензией течение 3 пассажей они без каких-либо клеток помещают на хранение в жидкий трудностей снимаются со стекла и пеазот (минус 196°С). ресеиваются. 45 Из приведенных примеров 1-3 слеПосле 20-дневного хранения осущест- дует, что предлагаемый криопротектор вляют деконсервацию клеток путем отоММЭГ обладает более высокой степенью грева на водяной бане при 37 в С. Раззащиты, чем глицерин, при этом он мемороженные клетки переносят в культунее токсичен. ральные флаконы, добавляя питательнук>50 Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я среду до посевной концентрации клеПрименением -монометилового эфира ток (2,1 10 £ /мл). Культивирование глицерина в качестве криопротектора. осуществляют при 37°С, производя че~ ВНИИПИ Заказ 857/24 Тираж 372 Подписное Произв.-полнгр. ггр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4