Спосіб визначення інгібуючої активності копрофільтратів по відношенню до представників нормальної мікрофлори, що входять до складу пробіотиків

Корисна модель відноситься до області медицини, зокрема до педіатрії, гастроентерології та клінічної мікробіології і може бути використаний для раціонального застосування пробіотиків при лікуванні дисбіотичних порушень кишечника у дітей. Дослідженням властивостей копрофільтратів займались багато авторів: [Червинец В.М., Бондаренко В.М., Виноградов В.Ф., Червинец Ю.В. Способ определения казеинолитической активности микроорганизмов при экспрэсс-диагностике дисбактериоза кишечника. РФ. Пат. №2235324; Зубова В.В., Завгородняя ЕФ. Способ определения степени тяжести дисбактериоза кишечника у детей. РФ. Пат. №2027996; Погорельская Л.В., Шапошникова Л.И., Ваулина О.В. Способ коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта. РФ. Пат. №2217156.]. Відомі способи діагностики дозволяють оцінити стан мікробіоценозу кишечника, визначити протеолітичну активність мікроорганізмів при діагностиці дисбіотичних порушень кишечника. Недоліком аналогів є те, що відсутній диференційований підхід до призначення пробіотиків в залежності від впливу копрофільтратів на представників нормальної мікрофлори, що входять до складу пробіотиків. На основі отриманих даних можна застосовувати пробіотичні препарати в клінічній практиці враховуючи ли ше їх загальновідому здатність до антагонізму. Серед опублікованих матеріалів є багато даних про вивчення інгібуючого впливу шлункового соку та жовчних кислот на лактобацили та біфідобактерії, що входять до складу пробіотичних препаратів. Але в патентних та науково-технічних джерелах не виявлено способу визначення інгібуючої активності копрофільтратів по відношенню до представників нормальної мікрофлори, що входить до складу пробіотиків. В основу корисної моделі способу визначення інгібуючої активності копрофільтратів по відношенню до представників нормальної мікрофлори, що входять до складу пробіотиків, що заявляється покладено задачу удосконалити застосування пробиотиків для корекції дисбіотичних порушень кишечника у дітей шля хом визначення інгібуючих властивостей супернатанту фекалій по відношенню до лактобацил та біфідобактерій, які входять до складу комерційних пробіотичних препаратів, що забезпечує раціональний вибір пробіотика та поліпшення результатів лікування дисбіотичних розладів кишечника у дітей. Поставлена задача способу визначення інгібуючої активності копрофільтратів по відношенню до представників нормальної мікрофлори, що входять до складу пробіотиків вирішується шляхом визначення інгібуючої активності копрофільтратів за розміром зони затримки росту кисломолочних бактерій , виділених з пробіотиків, на щільному поживному середовищі навколо лунки, в які згідно винаходу вноситься супернатант фекалій і оцінюється: при діаметрі зон від 10 до 40мм інгібуючу активність копрофільтратів вважають високою, при діаметрі зон від 7 до 9мм - низькою, при відсутності зони затримки росту реєстр ують негативний результат. Спосіб визначення інгібуючої активності копрофільтратів по відношенню до представників нормальної мікрофлори, що входять до складу пробіотиків полягає, насамперед, в приготуванні 10% супернатанту фекалій на фізіологічному розчині та очищені його від бактерій, що містяться в кишечнику за допомогою бактеріального мембранного фільтра ( Filltropurs). З чистої культури лактобацил та біфідобактерій, виділених з пробіотичних препаратів готують суспензію мікроорганізмів за стандартом мутності 5 ОД(ГІСКу ім. Л.О. Тарасевича). З робочої завісі готують серію десятикратних розведень на фізіологічному розчині. При дослідженні використовують розведення 106 для створення на поверхні агаризованого середовища рівномірного мікробного газону необхідної густини. По 1мл суспензії з даного розведення, що відповідає 5´106КУО/мл висівають на щільні поживні середовища: MRS для лактобацил та середовище Блаурока для біфідобактерій. На поверхні агару роблять лунки діаметром 6мм, в які вносять 0,05мл супернатанту фекалій. В контрольну лунку вносять фізіологічний розчин. Чашки інкубують в термостаті при t 37°C протягом 48 годин. Облік результатів проводять за наявністю зони затримки росту представників нормальної мікрофлори навколо лунки з копрофільтратом. Діаметри зон інгібіції вимірюють в міліметрах (мм). В результаті вимірювання зон інгібуючу активність супернатанту фекалій вважають високою при діаметрі зон від 10 до 40мм, низькою при діаметрі зон від 7 до 9мм. Негативний результат реєструють при відсутністі зони затримки росту. Приклад 1. Володимир К., 1 рік,знаходився на стаціонарному лікуванні у інфекційно-боксованому відділенні дитячих клінік ІПАГ АМН України. Клінічний діагноз: ентероколіт з явищами дисбактеріозу кишечника. При мікробіологічному дослідженні фекалій виявлено значне зниження кількості представників індигенної мікрофлори - лактобацилл до 105КУО/мл та біфідобактерій до 106КУО/мл. Вивчення кількісного рівня умовнопатогенної флори свідчило про активну контамінацію кишковика різними видами ентеробактерій: гемолітична кишкова паличка - 6,3´107КУО/г, клебсієла - 7,1´107КУО/г. Підвищеною була концентрація золотистого стафілококу – 2,3´105КУО/г. Для корекції дисбіотичних явищ кишечника пацієнту в клініці була призначена пробіотикотерапія із застосуванням «Лактобактерину». Для визначення інгібуючої активності копрофільтратів по відношенню до представників нормальної мікрофлори, які входить до складу пробіотиків вносили супернатант фекалій, вільних від бактерій, в лунки на щільному поживному середовищі , з попередньо засіяними лактобацилами та біфідобактеріями, виділених з пробіотичних препаратів. Для дослідження, крім призначеного препарату «Лактобактерин» до складу якого входить Lactobacillus plantarum, для порівняння використовували «Біфідобактерин» до складу якого входять Biphidobacterium biphidum, та мультипробіотик «Симбітер» до складу якого входять Lactobacillus acidophilus і Biphidobacterium longum. Облік результатів проводили за наявністю зони затримки росту представників нормальної мікрофлори навколо лунки з супернатантом фекалій. В результаті вимірювання зон інгібуючу активність супернатанту фекалій вважали високою при діаметрі зони від 10 до 40мм, низькою при діаметрі зони від 7 до 9мм. Негативним результат вважали при відсутності зони затримки росту нормальної мікрофлори. Копрофільтрати хворого К інгібували ріст Lactobacillus plantarum - спостерігалась зона затримки росту лактобацил 42мм. та Biphidobacterium biphidum - зона затримки росту біфідобактерій становила 18мм. Інгібуючого впливу копрофільтратів не спостерігалось по відношенню до лактобацил та біфідобактерій, які входять до складу мультипробіотика «Симбітер». Таким чином, мультипробіотик «Симбітер» можна рекомендувати для застосування в клінічній практиці для лікування дисбіотичних розладів кишечника хворого К. Для корекції дисбіотичних явищ кишечника пацієнту в клініці була призначена пробіотикотерапія із застосуванням мультипробіотика «Симбітер» замість «Лактобактерину». Ефективність вибору пробіотика оцінювали після курсу лікування рекомендованим препаратом. Контрольне мікробіологічне дослідження фекалій було проведено через 1 місяць після закінчення курсу пробіотикотерапії. Відмічений нормалізуючий ефект на рівень колонізації кишечника захисною мікрофлорою. Концентрація молочнокислих бактерій підвищилася та досягла показників норми - лактобацилли - 107КУО/мл та біфідобактерії - 109КУО/мл. Після лікування спостерігалась повна елімінація з біотопу гемолітичної кишкової палички та золотистого стафілококу. Концентрація клебсієли знизилась та становила 8´105КУО/г, що не перевищує показників норми. Приклад 2. Ірина М., 2 роки, знаходилась на стаціонарному лікуванні у інфекційно-боксованому відділенні дитячих клінік ІПАГ АМН України. Клінічний діагноз: ентероколіт середньої важкості з явищами дисбактеріозу кишечника. При мікробіологічному дослідженні фекалій виявлено суттєве зниження концентрації представників індигенної мікрофлори - лактобацил до 105КУО/мл та повна відсутність біфідобактерій. На цьому фоні відмічено збільшення кількості умовно-патогенної мікрофлори: Enterobacter cloacae - 4,2´107КУО/г, гриби роду Candida - 3,1´105КУО/г. Для корекції дисбіотичних явищ кишечника дитині була призначена пробіотикотерапія із застосуванням «Біфідобактерину». Для визначення інгібуючої активності копрофільтратів по відношенню до представників нормальної мікрофлори, які входить до складу пробіотиків вносили супернатант фекалій, вільних від бактерій, в лунки на щільному поживному середовищі, з попередньо засіяними лактобацилами та біфідобактеріями, виділених з пробіотичних препаратів. Для дослідження, крім призначеного препарату «Біфідобактерин» до складу якого входять Biphidobacterium biphidum для порівняння використовували «Лактобактерин» до складу якого входить Lactobacillus plantarum, та мультипробіотик «Симбітер» до складу якого входять Lactobacillus acidophilus і Biphidobacterium longum. Облік результатів проводили за наявністю зони затримки росту представників нормальної мікрофлори навколо лунки з супернатантом фекалій. В результаті вимірювання зон інгібуючу активність супернатанту фекалій вважали високою при діаметрі зони від 10 до 40мм, низькою при діаметрі зони від 7 до 9мм. Негативним результат вважали при відсутності зони затримки росту нормальної мікрофлори. Копрофільтрат хворої М. інгібував ріст Lactobacillus plantarum - спостерігалась зона затримки росту лактобацил 25мм та Biphidobacterium biphidum – зона затримки росту біфідобактерій становила 15мм. Інгібуючого впливу копрофільтратів не спостерігалось по відношенню до лактобацил та біфідобактерій, які входять до складу мультипробіотика «Симбітер». Тож, мультипробіотик «Симбітер» був рекомендован для лікування дисбіотичних розладів кишечника хворої М. Але в клініці проводили лікування дитини раніше обраним пробіотиком «Біфідобактерин». Ефективність вибору пробіотика оцінювали після курсу лікування цим препаратом. Контрольне мікробіологічне дослідження фекалій було проведено через 1 місяць після закінчення курсу пробіотикотерапії. Нормалізуючий ефект на рівень колонізації кишечника захисною мікрофлорою не спостерігався. Кількісні показники контамінації біотопу лактобацилами не досягла показників норми і становила 106КУО/мл. Після пробіотикотерапії біфідобактерій також не вдалося виявити з кишечника хворої М. Концентрація умовнопатогенної мікрофлори мала лише тенденцію до зниження, але залишалась на високому рівні(Enterobacter cloacae - 3,8´107КУО/г, гриби роду Candida - 2,9´105КУО/г), що свідчить про неефективність застосування пробіотичного препарату «Біфідобактерин»для лікування хворої М. Як видно з прикладів , спосіб визначення інгібуючої активності копрофільтратів по відношенню до представників нормальної мікрофлори, які входять до складу пробіотиків, сприяє науково обґрунтованому, раціональному вибору пробіотичного препарату, що проявляється у поліпшенні результатів лікування дисбіотичних порушень кишечника у дітей.