Спосіб визначення індивідуальної чутливості умовно-патогенних мікроорганізмів до пробіотичних препаратів методом дифузії в агар

Корисна модель відноситься до області медицини, зокрема до педіатрії, гастроентерології та клінічної мікробіології і може бути використана для раціонального застосування пробіотичних препаратів при лікуванні дисбіотичних порушень кишечника у дітей. Відомо декілька способів визначення чутли вості умовно-патогенних мікроорганізмів до пробіотичних препаратів, основаних на визначенні антагоністичної активності лактобацил [Глушанова Н.А., Блинов А.И., Ба хав В.В. Об антагонизме пробиотических лактобацилл //Эпидемиология и инфекционные болезни. - №6. - 2004; Ермоленко Е.И., Исаков В.А., Ждан - Пушкина С.Х., Тец В.В. Количественная оценка антагонистической активности лактобацилл //Журнал микробиологии, эпидемиологии, иммунологии. - №5. – 2005]. Відомі способи дозволяють визначати антагоністичну властивість пробіотиків по відношенню до умовнопатогенних мікроорганізмів методом двошарового агару або методом сумісного культивування на чашці Петрі. Недоліками способів є те, що вони потребують тривалої підготовки та складних поживних середовищ для постановки дослідження, а відсутність кількісних критеріїв обліку результатів не дає можливості правильно оцінити проведене дослідження. Дослідженням антагоністичних властивостей лактобацил, які входять до складу пробіотиків, по відношенню до умовно-патогенних мікроорганізмів займались багато дослідників, але практика свідчить про не завжди ефективне застосування пробіотичних препаратів в клінічній практиці. Найбільш близьким до об’єкта, що заявляється є спосіб визначення чутливості мікроорганізмів, що входять до складу пробіотиків по відношенню до умовно-патогенних мікроорганізмів методом відстроченого антагонізму, що передбачає посів штрихом 1млрд./мл суспензії мікроорганізмів із препаратів - пробіотиків посередині чашки з наступною інкубацією посівів 24 години при 37°С. Через 24 години підсівають 1млрд./мл суспензій умовнопатогенних мікроорганізмів та інкубують при 37°С ще 24 години, після чого враховують зони відсутності росту мікроорганізмів у мм. [Риженко С.А. Антагоністична активність пробіотиків у відношенні мікроорганізмів //Анали Мечниковського Інституту. - №1. – 2005]. Недоліком способу є те, що для отримання результатів потрібен тривалий час. Це обумовлено тим, що для росту лактобацил потрібно від 48 до 72 годин. Ще одним недоліком способу є те, що для дослідження потрібне поживне середовище на якому б росли як умовно-патогенні бактерії так і представники індигенної мікрофлори (лактобацили та біфідобактерії). Крім того, важко оцінити результати із-за відсутності чітких границь зони затримки росту мікроорганізмів. В основу корисної моделі , що заявляється покладено задачу створення способу визначення індивідуальної чутливості умовно-патогенних мікроорганізмів до пробіотичних препаратів методом дифузії в агар шляхом визначення антагоністичної активності мікроорганізмів, які входять до складу пробіотиків по відношенню до виділених від хворого умовно-патогенних мікроорганізмів, що забезпечує підвищення ефективності лікування дисбіотичних порушень кишечника пробіотичними препаратами та дає змогу прискорити отримання результатів. Поставлена задача способу визначення індивідуальної чутливості умовно-патогенних мікроорганізмів до пробіотичних препаратів методом дифузії в агар вирішується шляхом визначення антагоністичної активності мікроорганізмів, які входять до складу пробіотиків по відношенню до виділених від хворого умовно-патогенних мікроорганізмів, згідно корисної моделі додатково вносяться пробіотики в лунки на щільному поживному середовищі з попередньо засіяними умовно-патогенними мікроорганізмами, виділеними з кишечника хворого, облік результатів проводять за наявністю зони затримки росту умовно-патогенних бактерій навколо лунки з пробіотиком і оцінюються: при діаметрі зони від 10 до 20мм – мікроорганізми чутливі до препаратів - пробіотиків, при діаметрі зони від 7 до 9мм - слабо чутливі, а при відсутності зони затримки росту мікроорганізмів навколо лунки з пробіотиком - стійкі. Спосіб визначення індивідуальної чутливості умовно-патогенних мікроорганізмів до пробіотичних препаратів методом дифузії в агар полягає в тому, що з чистої культури виділених від хворого умовно-патогенних мікроорганізмів готують суспензію бактерій за стандартом мутності 5ОД (ГІСКу ім. Л.О. Тарасевича). З робочої завісі готують серію десятикратних розведень на фізіологічному розчині. При дослідженні використовують розведення 105 для створення на поверхні агаризованого середовища рівномірного мікробного газону необхідної густини. По 1мл суспензії з даного розведення, що відповідає 5х105КУО/мл висівають на агаризовані поживні середовища: жовточно-сольовий агар для стафілококів, середовище Ендо - для ентеробактерій, середовище Сабуро - для грибів роду Candida. На поверхні агару роблять лунки діаметром 6мм, в які вносять 0,05мл пробіотичного препарату. В контрольну лунку вносять фізіологічний розчин. Чашки інкубують в термостаті при t 37°C протягом 24 годин . Після інкубації в термостаті вимірюють діаметри зон затримки росту умовно-патогенних мікроорганізмів навколо лунки з пробіотиком. Діаметри зон вимірюють в міліметрах (мм). Мікроорганізми вважають чутливими до препаратів робіотиків при діаметрі зон від 10 до 20мм, слабо чутливими при діаметрі зон від 7 до 9мм. При відсутністі зони затримки росту навколо лунки з пробіотиком мікроорганізми вважають стійкими. Навколо контрольної лунки з фізіологічним розчином зони затримки росту не повинно спостерігатись. Приклад 1. Віктор О., 1 рік , знаходився на стаціонарному лікуванні у інфекційно-боксованому відділенні дитячих клінік ІПАГ АМН України. Клінічний діагноз: ентероколіт з явищами дисбактеріозу кишечника. При мікробіологічному дослідженні фекалій виявлено значне зниження кількості представників індигенної мікрофлори - лактобацилл до 105КУО/мл та біфідобактерій до 106УО/мл. Концентрація умовно-патогенної флори перевищувала показники норми : клебсієла - 5,2х107КУО/г золотистий стафілокок - 2,8х105 КУО/г, гриби роду Candida - 1,5х105КУО/г. Для корекції дисбіотичних явищ кишечника пацієнту була призначена терапія із застосуванням пробіотика «Лактовіт-форте». Для визначення індивідуальної чутливості умовно-патогенних мікроорганізмів до дії пробіотиків з чистої культури виділених від хворого умовно-патогенних мікроорганізмів - клебсієли, золотистого стафілококу та грибів роду Candida готували суспензію бактерій за стандартом мутності 5ОД (ГІСКу ім. Л.О. Тарасевича). З робочої завісі готували серію десятикратних розведень на фізіологічному розчині. При дослідженні використовували розведення 106 для створення на поверхні агаризованого середовища рівномірного мікробного газону необхідної густини. По 1мл суспензії з даного розведення, що відповідає 5х106КУО/мл висівали на щільні поживні середовища: жовточно-сольовий агар для стафілококу, середовище Ендо - для клебсієли , середовище Сабуро для грибів роду Candida. На поверхні агару робили лунки діаметром 6мм, в які вносили 0,05мл пробіотичних препаратів. Для дослідження, крім призначеного препарату «Лактовіт-форте» до складу якого входять Lactobacillus plantarum, фолієва кислота та вітамін В12 для порівняння використовували «Лактобактерин» до складу якого входить Lactobacillus plantarum, «Ентерол», що містить лікувальні дріжджі Saccharomyces boulardii, «Біфідобактерин» до складу якого входять Biphidobacterium biphidum та мультипробіотик «Симбітер ацидофільний» до складу якого входять Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Biphidobacterium longum, Biphidobacterium biphidum, Lactococcus lactis та Propionibacterium acidipropionici. В контрольну лунку вносять фізіологічний розчин. Чашки інкубують в термостаті при t 37°С протягом 24 годин. Після інкубації в термостаті вимірювали діаметри зон затримки росту умовно-патогенних мікроорганізмів навколо лунки з пробіотиком. Діаметри зон вимірюють в міліметрах (мм). В результаті вимірювання зон антагоністичної активності препаратів - пробіотиків мікроорганізми вважали чутливими при діаметрі зон від 10 до 20мм, слабо чутливими при діаметрі зон від 7 до 9мм. При відсутністі зони затримки росту навколо лунки з пробіотиком мікроорганізми вважали стійкими. St. aureus, виділений з кишечника хворого О. виявився чутливим до дії пробіотиків «Симбітер ацидофільний» - зона затримки росту ста філокока становила 15мм; «Лактобактерин» - зона затримки росту дорівнювала 11мм; «Лактовіт-форте» - зона затримки росту ста філокока становила 10мм. До дії пробіотичних препаратів «Біфідобактерин» та «Ентерол» золотистий стафілокок виявився слабо чутливим, зони затримки росту мікроорганізму становили 7мм та 9мм відповідно. Klebsiella pn., виділена з кишечника хворого виявилась чутливою до пробіотика «Симбітер ацидофільний» зона затримки росту становила 12мм. Слабо проявляв свою антагоністичну властивість по відношенню до клебсієли пробіотик «Лактобактерин» - зона затримки росту мікроорганізму становила 7мм. Навколо лунок з пробіотиками «Лактовіт-форте», «Біфідобактерин» та «Ентерол» зони затримки росту клебсієли не спостерігалось, що свідчить про те, що даний мікроорганізм стійкий до дії цих пробіотиків. Гриби роду Candida виявились чутливими лише до дії пробіотика «Симбітер ацидофільний» - зона затримки росту становила 12мм. До дії всіх інши х пробіотичних препаратів гриби роду Candida виявились стійкими. Таким чином, для застосування в клінічній практиці при лікуванні дисбіотичних розладів кишечника хворого О., викликаних умовно-патогенними мікроорганізмами можна рекомендувати мультипробіотик «Симбітер ацидофільний», який проявляє широкий спектр антагоністичної активності проти умовно-патогенних бактерій. Для корекції дисбіотичних явищ кишечника пацієнту на основі проведеного дослідження була призначена терапія із застосуванням пробіотика «Симбітер ацидофільний» замість «Лактовіт-форте». Ефективність вибору пробіотика оцінювали після курсу лікування рекомендованим препаратом. Контрольне мікробіологічне дослідження фекалій було проведено через 1 місяць після закінчення курсу пробіотикотерапії. Відмічений нормалізуючий ефект на рівень колонізації кишечника захисною мікрофлорою. Концентрація молочнокислих бактерій підвищилася та досягла показників норми - лактобацилли - 107КУО/мл та біфідобактерії - 109КУО/мл. Після лікування спостерігалась повна елімінація з біотопу золотистого стафілококу. Концентрація клебсієли після лікування становила 6х105КУО/г, а грибів роду Candida - 103КУО/г, що не перевищує показників норми. Приклад 2. Ольга З., 1 рік 8міс , знаходився на стаціонарному лікуванні у інфекційно-боксованому відділенні дитячих клінік ІПАГ АМН України. Клінічний діагноз: ентероколіт з явищами дисбактеріозу кишечника, викликаний умовно-патогенною мікрофлорою. При мікробіологічному дослідженні фекалій виявлено значне зниження кількості представників індигенної мікрофлори - лактобацилл до 105КУО/мл та біфідобактерій до 106КУО/мл. Концентрація умовно-патогенної флори перевищувала показники норми: Proteus vulgaris – 8,2x107КУО/г, St. Aureus – 1,4x10 5КУО/г, Для корекції дисбіотичних явищ кишечника, дитині в клітці була призначена терапія із застосуванням пробіотика «Ентерол». Для визначення індивідуальної чутливості умовно-патогенних мікроорганізмів до дії пробіотиків з чистої культури виділених від хворого умовно-патогенних мікроорганізмів - Proteus vulgaris та St. aureus готували суспензію бактерій за стандартом мутності 5ОД (ГІСКу ім, Л.О. Тарасевича). З робочої завісі готували серію десятикратних розведень на фізіологічному розчині. При дослідженні використовували розведення 10 6 для створення на поверхні агаризованого середовища рівномірного мікробного газону необхідної густини. По 1мл суспензії з даного розведення, що відповідає 5х106КУО/мл висівали на щільні поживні середовища: жовточносольовий агар для стафілококу, середовище Ендо - для Proteus vulgaris. На поверхні агару робили лунки діаметром 6мм, в які вносили 0,05мл пробіотичних препаратів. Для дослідження, крім призначеного препарату«Ентерол», що містить лікувальні дріжджі Saccharomyces boulardii, використовували «Лактовіт-форте» до складу якого входять Lactobacillus plantarum, фолієва кислота та вітамін В12 «Лактобактерин» до складу якого входить Lactobacillus plantarum, «Біфідобактерин» до складу якого входять Biphidobacterium biphidum та мультипробіотик «Симбітер ацидофільний» до складу якого входять Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Biphidobacterium longum, Biphidobacterium biphidum, Lactococcus lactis та Propionibacterium acidipropionici. В контрольну лунку вносили фізіологічний розчин. Чашки інкубують в термостаті при t 37°С протягом 24 годин . Після інкубації в термостаті вимірювали діаметри зон затримки росту умовно-патогенних мікроорганізмів навколо лунки з пробіотиком. Діаметри зон вимірюють в міліметрах (мм). В результаті вимірювання зон антагоністичної активності препаратів - пробіотиків мікроорганізми вважали чутливими при діаметрі зон від 10 до 20мм, слабо чутливими при діаметрі зон від 7 до 9мм. При відсутністі зони затримки росту навколо лунки з пробіотиком мікроорганізми вважають стійкими. St. aureus , виділений з кишечника хворої 3. виявився чутливим до дії пробіотиків «Симбітер ацидофільний» зона затримки росту ста філокока становила 18мм; «Лактобактерин» та«Ентерол» - зона затримки росту дорівнювала 12мм; «Лактовіт-форте» - зона затримки росту ста філокока становила 10мм; До дії пробіотичного препарату «Біфідобактерин» золотистий стафілокок виявився слабо чутливим , зони затримки росту мікроорганізму становили 7мм. Proteus vulgaris, виділений з кишечника хворого виявився чутливим лише до пробіотика «Симбітер ацидофільний» - зона затримки росту становила 14мм. Антагоністичну властивість по відношенню до Proteus vulgaris пробіотики «Лактобактерин» «Лактовіт-форте», «Біфідобактерин» та «Ентерол» на проявляли - зони затримки росту даного мікроорганізму не спостерігалось, що свідчить про те, що Proteus vulgaris стійкий до дії цих пробіотиків. Таким чином, для застосування в клінічній практиці при лікуванні дисбіотичних розладів кишечника хворого 3., викликаних умовно-патогенними мікроорганізмами можна рекомендувати мультипробіотик «Симбітер ацидофільний», який проявляє антагоністичну активність не тільки проти St. aureus, а і Proteus vulgaris. Але для корекції дисбіотичних явищ кишечника пацієнту , незважаючи на проведене дослідження, була призначена терапія із застосуванням пробіотика «Ентерол». Ефективність вибору пробіотика оцінювали після курсу лікування даним препаратом. Контрольне мікробіологічне дослідження фекалій було проведено через 3 тижні після закінчення курсу пробіотикотерапії. Нормалізуючий ефект на рівень колонізації кишечника захисною мікрофлорою не спостерігався. Кількісні показники контамінації біотопу умовно-патогенними бактеріями залишились без змін., що свідчить про неефективність застосування пробіотичного препарату «Ентерол» для лікування дисбіозу кишечника хворої 3. На основі проведеного дослідження, для корекції дисбіотичних порушень хворої З. була застосована пробіотикотерапія із використанням пробіотичного препарату «Симбітер ацидофільний». Ефективність вибору пробіотика оцінювали після курсу лікування рекомендованим препаратом. Контрольне мікробіологічне дослідження фекалій було проведено через 1 місяць після закінчення курсу пробіотикотерапії. Відмічений нормалізуючий ефект на рівень колонізації кишечника захисною мікрофлорою. Концентрація молочнокислих бактерій підвищилася та досягла показників норми - лактобацилли - 107КУО/мл та біфідобактерії – 109КУО/мл. Після лікування спостерігалась повна елімінація з біотопу золотистого стафілококу. Концентрація Proteus vulgaris після лікування становила 102КУО/г, що не перевищує показників норми. Як видно з наведених прикладів, спосіб визначення індивідуальної чутливості умовно-патогенних мікроорганізмів до пробіотичних препаратів методом дифузії в агар, що пропонується, сприяє підвищенню ефективності застосування пробіотичних препаратів в клінічній практиці для лікування дисбіотичних порушень кишечника.