Спосіб контролю ефективності протипухлинної аутовакцини у хворих на рак кишкового тракту

Корисна модель, що заявляється, відноситься до медицини, а саме онкології і може використовуватися для контролю ефективного застосування протипухлинної аутовакцини у хворих зі злоякісними новоутвореннями кишкового тракту. Вплив протипухлинної вакцини на організм хворого може реалізовуватись у вигляді гальмування, стабілізації чи активації процесів синтезу супероксидних радикалів та оксиду азоту імунокомпетентними клітинами. Підґрунтям реакції-відповіді організму на вплив аутовакцини є вираженість початкового ступеня редокс-порушень в клітинах та ступінь їх компенсованості, що є одним з критеріїв ефективного застосування аутовакцини. У нейтрофільних гранулоцитах крові функціонують дві системи - NAD(Р)Н-оксидаза та індуцибельна синтаза оксиду азоту (iNOS), які генерують супероксидні радикал-аніони (O2-) і оксид азоту (NO) відповідно, та виступають в ролі ефекторних молекул в реакціях відповіді при формуванні неспецифічної резистентності організму. Супероксидні радикал-аніони та оксид азоту, продуковані нейтрофільними гранулоцитами та іншими імунокомпетентними клітинами, здатні не тільки спричинювати протипухлинну дію (цитотоксичну, цитостатичну), але і викликати пошкодження здорових клітин організму шля хом інактивації ряду ферментів, зміни структури ДНК, окисного пошкодження базальних мембран та деструкції міжклітинного матриксу матриксними металопротеїназами. Генеровані в фізіологічних кількостях, дані молекули задіяні в реакціях-відповідях клітини, починаючи від транскрипційної активації до клітинної проліферації та апоптозу. Інтенсифікація генерування супероксидних радикал-аніонів, оксиду азоту вимагає стимулюючого впливу і перебуває в динамічній рівновазі з пусковими факторами та системами елімінування. За фізіологічних умов активація імунокомпетентних клітин здійснюється за принципом доцільності, а рівень активації є причинно обґрунтованим. У хворих на рак кишкового тракту визначаються порушення наведених принципів в сторону індивідуально вираженої неконтрольованої активації NAD(Р)Н-оксидазної та NO-синтазної систем в клітинах та тканинах. Відомий спосіб контролю застосування протипухлинної вакцини, який базується на блокуванні імунної системи, що активована Т-клітинами, імунорегульованими молекулами, цитотоксичними Т-лімфоцитами, асоційованими з антигеном 4 (CTLA-4) у пацієнтів, чутливи х до ци х впливів [1]. Однак, даний спосіб не дає кількісної оцінки стану реактивності імунокомпетентних клітин та пошкоджуючим ефектам, які реалізовані за їх участю. Задача способу, що заявляється, полягає в кількісній оцінці редокс-стану пухлини та/або тканин, які її оточують, та імунокомпетентних клітин з тим, щоб зробити висновок про тип впливу протипухлинної аутовакцини на імунокомпетентні клітини та пухлину. Задача вирішена шляхом визначення рівнів генерування супероксидних радикал-аніонів, оксиду азоту пухлиною та/або прилеглою до пухлини тканиною та нейтрофільними гранулоцитами за допомогою методу електронного парамагнітного резонансу (ЕПР) та технології спінових уловлювачів, а методом зимографії активності матриксних металопротеїназ (ММП-2 та ММП-9) в пухлині та/або прилеглій до пухлини тканині хворих на рак кишкового тракту при дії протипухлинної аутовакцини. Суть способу полягає в тому, що методом ЕПР і технології спінових уловлювачів визначають рівні генерування супероксидних радикал-аніонів, оксиду азоту в пухлині та/або прилеглій до неї тканині та нейтрофільними гранулоцитами, а методом зимографії - в пухлині та/або прилеглій до неї тканині - рівні активності ММП-2 і ММП-9 до і після інкубації з активованими аутовакциною нейтрофільними гранулоцитами і оцінюють їх. Зниження або стабілізація рівнів генерування супероксидних радикал-аніонів і оксиду азоту в пухлині та нейтрофільними гранулоцитами після інкубації з протипухлинною аутовакциною і рівня активності матриксних металопротеїназ в пухлині або прилеглій до неї тканині після інкубації з нейтрофільними гранулоцитами, на які попередньо впливала аутовакцина, свідчить про ефективність вакцини. При зростанні рівнів генерування радикалів кисню, оксиду азоту та активності ММП-2 і ММП-9 судять про неефективну дію протипухлинної аутовакцини. Спосіб здійснюють наступним чином. Перед вакцинацією із 3мл венозної крові хворого на 3% трилоні В виділяють нейтрофільні гранулоцити клітини за відомим способом [2]. Частину виділених нейтрофілів інкубують 2 год при t=36°С з протипухлинною аутовакциною; друга частина цих клітин слугує за контроль. В інкубованих та контрольних зразках проводять вимірювання рівнів генерування супероксидних радикал-аніонів з використанням спінового уловлювача 2,2,6,6-тетраметил-4-оксипіперидину та методу ЕПР у спеціальній кварцовій кюветі при кімнатній температурі та реєструють рівні синтезу оксиду азота з використанням спінового уловлювача диетилдитіокарбамату та методу ЕПР при температурі рідкого азоту (77К) в спеціальному кварцовому дюарі [3]. Після цього пухлинну тканину хворого та або тканину, яка її оточує, інкубують при t=36°С впродовж 2год з інтактними нейтрофільними гранулоцитами та з нейтрофільними гранулоцитами, попередньо інкубованими з протипухлинною аутовакциною. Після інкубації в зразках пухлинної тканини та або тканини, яка її оточує, визначають активність ММП-2 та ММП-9 методом зимографії в 12% поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію та 0,1% желатина в якості субстрату [4]. Аналіз отриманих результатів дає можливість оцінити ефекти, які спричинює аутовакцина в пухлині та нейтрофільних гранулоцита х. Дослідження проведені на 48-ми хворих злоякісними пухлинами кишкового тракту T2N0M0, T3N1M0 з ступенем диференціювання G2, яким здійснено оперативне втручання по видаленню пухлини та чотирьохразове введення вакцини по стандартній схемі. У всіх хворих реєстр ували: 1. Рівні швидкості генерування супероксидних радикал-аніонів і оксиду азоту в пухлині та/або тканиною, що оточує її, до та після інкубації з нейтрофільними гранулоцитами, які попередньо інкубувались з протипухлинною аутовакциною in vitro. 2. Рівні швидкості генерування супероксидних радикал-аніонів та оксиду азоту нейтрофільними гранулоцитами крові до та після їх інкубування з протипухлинною ауто вакциною in vitro. 3. Активність матриксних металопротеіназ (ММП-2, ММП-9 ) в пухлині до та після інкубації з нейтрофільними гранулоцитами, активність яких модульована аутовакциною. Аналіз отриманих даних свідчить, що у хворих на рак кишкового тракту швидкість генерування супероксидних радикал-аніонів в пухлині до інкубації становить 0,35-4,05нмоль/г сирої тканини × хв, а активність NO-синтазних систем - 1,6-5,6нмоль/г сирої тканини, а після інкубації з аутовакциною - може зростати або знижуватись і залежить від біологічних особливостей пухлини, ступеня диференціювання, тобто носять індивідуальний характер. Нейтрофільні гранулоцити цих хворих перед вакцинацією продукували радикал кисню із швидкістю 0,72,5нмоль/5,7×103клітин×хв. Активність iNOS в цих клітинах склала перед вакцинацією 0,8-5,65нмоль/×105,36 клітин. Активність ММП-2 та ММП-9 в п ухлині склала 80-245 та 245нг/г тканини. Отримані дані дали можливість оцінити потенційні можливості пухлин та нейтрофільних гранулоцитів, їх спроможність до генерування радикалу кисню та NO та потенційно оцінити ефекти, які можуть бути реалізовані ними в пухлині. Реакцію-відповідь нейтрофільних гранулоцитів на дію протипухлинної а утовакцини оцінюють in vitro. Для цього до 20×103 клітин додають 100мкл аутовакцини, витримують при 36°С 12 годин і вимірюють активність нейтрофільних гранулоцитів. Відповідь нейтрофільних гранулоцитів на дію вакцини реєструвалась такою: а) підсилення синтезу NO і супероксидних радикал-аніонів. б) стабілізація синтезу NO і супероксидних радикал-аніонів. в) гальмування синтезу NO і супероксидних радикал-аніонів. Активацію синтезу ефекторних молекул нейтрофільними гранулоцитами трактують як негативний фактор для застосування аутовакцини, а стабілізацію і гальмування - як позитивний. Крім того, проводять аналіз впливу на пухлину модифікованих аутовакциною нейтрофільних гранулоцитів з метою визначення рівнів активації ММП-2 і ММП-9. З цією метою 2г пухлини та/або прилеглої до неї тканини інкубували 2год з 20-10 клітин активованих аутовакциною. Можливі варіанти відповіді ММП в пухлині та/або прилеглій до неї тканині на дію супероксидних радикал-аніонів і оксиду азоту, синтезованих нейтрофільними гранулоцитами: підсилення, стабілізація та гальмування активності ММП. Негативним проявом впливу нейтрофільних гранулоцитів на ММП в злоякісних новоутвореннях кишкового тракту є підсилення їх активності в п ухлині та/або прилеглій тканині. Приклади виконання способу Приклад № 1. Пацієнт П. з діагнозом аденокарцинома ободової кишки T3N0M0 знаходився на стаціонарному лікуванні в Київській міській онкологічній лікарні. Після хірургічного видалення пухлини йому було проведено курс (4 введення) протипухлинної аутовакцини серії ІЕПОР. Перед вакцинацією у хворого рівень генерування супероксидних радикал-аніонів нейтрофільними гранулоцитами дорівнював 0,8нмоль/5,7×103клітин×хв, а рівень активності iNOS - 1,7нмоль/5,3×106клітин. В пухлині рівень утворення радикалу кисню становив 4,35нмоль/г вологої тканини×хв, а NO 9,83нмоль/г сирої тканини. Рівень активності ММП-2 і ММП-9 в п ухлині склав 145 та 320нг/г тканини, відповідно. Інкубування нейтрофільних гранулоцитів з протипухлинною аутовакциною призвело до підвищення швидкості генерування супероксидних радикал-аніонів від 0,8нмоль/5,7×103клітин×хв до 2,85нмоль/5,7×103клітин×хв, а синтезу оксиду азоту від 1,7нмоль/5,3×106клітин до 3,57нмоль/5,3×106клітин. Інкубація пухлини з аутовакциною та активованими аутовакциною нейтрофілами призвела до підвищення рівнів супероксидних радикал-аніонів та оксиду азоту. Зріс також рівень активності ММП-2 і ММП-9 за цих умов до 825 і 1280нг/г тканини, відповідно. Такі закономірності отримані і для тканини, яка оточує пухлин у. Тобто аутовакцина у цього хворого підвищує активність систем генерування радикалів кисню і оксиду азоту в пухлині, нейтрофільних гранулоцитах та ММП в пухлині та прилеглій до неї тканині, що свідчить про неефективність застосування аутовакцини. Приклад № 2. Хворий О. поступив в клініку із діагнозом Са recti T3N0M0. Перед вакцинацією активність нейтрофілів по продукуванню супероксидних радикал-аніонів була 2,14нмоль/5,7×103клітин×хв, NO - 5,6нмоль/5,3×106клітин. В пухлині швидкість генерування супероксидних радикал-аніонів склала 3,3нмоль/г вологої тканини×хв, а оксиду азоту - 4,8нмоль/г сирої тканини. Активність ММП-2 і ММП-9 в пухлині дорівнювала 95 та 260нг/г тканини, відповідно. При інкубації з вакциною нейтрофільних гранулоцитів їх активність до продукування радикалу кисню і оксиду азоту знизилась від 2,14 до 2,05 нмоль/5,7×103клітин×хв і від 5,6 до 3,5нмоль/5,3×106 клітин відповідно. Рівень продукування супероксидних радикал-аніонів і оксиду азоту в п ухлині після обробки її аутовакциною не змінився у порівнянні з показниками, які характерні для пухлини цього хворого. Активність ММП-2 і ММП-9 у пухлині після інкубації з вакциною та нейтрофільними гранулоцитами, які попередньо інкубувались з аутовакциною, майже не відрізнялась від показників, які були у пухлині до інкубації, тобто у цього хворого спостерігається тенденція до стримування вакциною систем генерування радикалів кисню та оксиду азоту в нейтрофільних гранулоцитах, п ухлині та активності ММП. Аналіз результатів, отриманих у цього хворого, трактують як позитивну реакцію організму на введення аутовакцини, що вказує на ефективність її застосування. Спосіб є високочутливим, неінвазивним і може бути використаний у всіх спеціалізованих онкологічних закладах, як тест-система на прогностичну оцінку для ефективного застосування протипухлинної аутовакцини. Джерела інформації: 1. Hodi S.F., Mihm M.C., Soiffer K.J. et al. Т lymphocyte-associated antigen 4 antibody blockade in previously vaccinated metastatic melanoma and ovarian carcinoma patients. // PNAS. - 2003; 100(8):4713. 2. Панасенко О.М., Чеканов А.В., Арнольд Ю., Сергиенко В.И., Осипов А.Н., Владимиров Ю.А. Образование свободных радикалов при распаде гидропероксида в присутствии миелопероксидазы или активированных нейтрофилов. // Биохимия. - 2005; 70(9): 1209-1217. 3. Бурлака А.П., Данко М.Й., Сидорик Є.П. Кінетичні закономірності швидкості генерування і вмісту радикалів кисню в мембранах ендоплазматичного ретикулуму при хімічному канцерогенезі печінки і молочних залоз. // Доп. АН України. - 1994. - 10: 141-145. 3. De Clerck Y. A. Pere z N., Shimada H., Boone T. C., Langley R. E. and Тау lor S. M. Inhibition of Invasion and metastasis in cells transfected with an inhibitor of metalloproteinases. // Cancer research. - 1992; 52:701-708.