Спосіб одержання протипухлинної аутовакцини

1 Спосіб одержання протипухлинної аутовакцини шляхом промивання пухлинної тканини фізіологічним розчином, її подрібнення, обробки клітин продуктом метаболізму штаму мікроорганізму та інкубації суміші, який відрізняється тим, що клітини обробляють продуктами метаболізму штаму Bacillus subtihs 1MB В-7025, а суміш шкубують протягом 0,5-1,0 години 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що як продукти метаболізму використовують фільтрат культуральної рідини штаму Bacillus subtihs 1MB В7025 в КІЛЬКОСТІ 1мл або виділений з нього лектин в дозі 0,06-0,5 мг/мл на 0,9х107-1,1х107 пухлинних клітин Excision plus neurommidase - treated tumor cells, bit J Cancer 1974, 13(1) 71-81] Проте даний спосіб не дозволяє досягти бажаного результату одержана цим способом вакцина має низьку профілактичну і терапевтичну ефективність, а на її приготування витрачають від 4 до 10 годин Найбільш близьким до способу, що заявляється, є приготування протипухлинної вакцини шляхом промивання пухлинної тканини фізіологічним розчином, и подрібнення та обробки пухлинних клітин фільтратом культуральної рідини штаму мікроорганізму Вас mesentencus АБ-56 [Затула Д Г Експериментальне обгрунтування практичного застосування специфічних протиракових вакцин Вісник АН УРСР 1982, 11 51-62 ], або поліпептидом кислої природи, виділеним з вищезгаданого фільтрату [Патент України №1667 МПК4 А 61К 35/12 від 15 10 93 Пріор 26 07 82, Бюл №3, 1994 прототип] Характерними ознаками є те, що при виготовленні 1мл вакцини беруть 1,0x107 - 1,2x107 пухлинних клітин і обробляють 1мл фільтрату або 0,25-1,0мг/мл поліпептіду з м в 26 500 дальтон, суміш шкубують в термостаті протягом 1-2 годин, періодично струшуючи Після закінчення інкубації вакцину досліджують на стерильність і на життєздатність пухлинних клітин Однак, одержана таким чином протипухлинна вакцина не забезпечує необхідну на сьогодні про О (О 00 ю 57869 філактичну і терапевтичну ефективність Крім того при одержанні ад'ювантної речовини - фільтрату чи поліпептиду використовують дороге поживне середовище Тому у своїх дослідженнях ми надавали особливого значення пошукам ад'ювантної речовини, яка б проявляла цитотоксичну активність по відношенню до пухлинних клітин різного гистогенезу (саркома-37, рак Ерліха, лімфома NK/Ly, лімфосаркома ОН-2, плазмоцитома ОН-3, карцинома Льюіс), та була б значно дешевшою Такими виявились фільтрат культуральної рідини штаму мікроорганізму Вас subtihs 1MB В-7025 [Заявка на винахід №2001042565 від 17 05 2001 Штам бактерій Bacillus subtihs продуцент протипухлинних цитотоксичних речовин], а також одержана з нього біологічно активна речовина - лектин, що проявляли необхідні властивості Даний фільтрат і лектин in vitro не тільки девіталізували пухлинні клітини in vitro, але попередньо аглютинували і частково їх лізували, підсилючи при цьому імуногенність клітин Ця синергічна дія продуктів метаболізму штаму мікроорганізму В subtihs 1MB В7025 і була використана при одержанні протипухлинної аутовакцини за новою технологією В основу винаходу, що заявляється, поставлено задачу удосконалення способу одержання протипухлинної аутовакцини шляхом обробки пухлинних клітин ад'ювантною, нешкідливою для організму речовиною з високою цитотоксичною активністю по відношенню до пухлинних клітин різного гистогенезу з тим, щоб забезпечити значне підвищення біологічної активності протипухлинної вакцини при зменшенні витрат на її приготування Поставлена задача вирішується тим, що пухлинні клітини обробляють продуктами метаболізму штаму В subtihs 1MB В-7025, а суміш шкубують протягом 0,5-1,0 години Спосіб характеризується тим, що 0,9х107 - 1,1х107 пухлинних клітин обробляють 1мл фільтрату культуральної рідини штаму вказаного мікроорганізму, або одержаним з нього пектином, з розрахунку 0,06-0,5мг/мл Удосконалення відомого способу полягає в застосуванні фільтрату культуральної рідини або лектину з вищою цитотоксичною активністю при виготовленні вакцини, які проявляють синергічну дію по відношенню до ракових клітин, що дозволяє підвищити и імуногенність, тобто підсилити протипухлинну резистентність і таким чином досягти значно вищої профілактичної і лікувальної ефективності, майже в 10 разів зменшити КІЛЬКІСТЬ ак тивної речовини, необхідної для одержання аутовакцини і у 2 рази скоротити інкубаційний період її приготування Використання продуктів метаболізму штам у-продуцента, який культивують на дешевих поживних середовищах робить також значний вклад в зменшення витрат при виготовленні вакцини Спосіб одержання протипухлинної аутовакцини здійснюють таким чином Пухлинну тканину тричі промивають стерильним фізіологічним розчином, подрібнюють, клітини обробляють продуктом метаболізму штаму мікроорганізму Вас subtihs 1MB В-7025, одержану суміш шкубують в термостаті при 37°С протягом 0,5-1,0 години, періодично струшуючи Для приготування 1 мл вакцини до 0,9x10 - 1,1х107 пухлинних клітин додають 1мл фільтрату культуральної рідини штаму вказаного мікроорганізму або 0,06-0,5мг/мл лектину, виділеного з цього фільтрату Після закінчення інкубації вакцину перевіряють на стерильність та життєздатність пухлинних клітин Протипухлинну активність вакцини досліджували на експериментальних тваринах Суть способу пояснюють приклади конкретного виконання Приклад 1 Пухлинну тканину сингенної лінії мишей BALB/c з прищепленою солідною формою аденокарциноми Ерліха тричі промивають, стерильним фізіологічним розчином, подрібнюють Для приготування 1мл вакцини 1,0x107 пухлинних клітин обробляють 1мл фільтрату культуральної рідини Суміш шкубують в термостаті при 37°С 1 годину, періодично струшуючи Після закінчення інкубації вакцину перевіряють на стерильність і життєздатність пухлинних клітин Виготовлену вакцину досліджують на протипухлинну активність При дослідженні профілактичної ефективності вакциною імунізують мишей лінії BALB/c Через 28 діб після імунізації мишам в черевну порожнину прищеплюють вірулентні пухлинні клітини Ерліха в КІЛЬКОСТІ 1 , 2 x 1 0 5 При дослідженні терапевтичної ефективності мишам лінії BALB/c прищеплюють 1,2x105 вірулентних пухлинних клітин Ерліха Через 24 години починають лікування вакциною Протипухлинну резистентність мишей до аденокарциноми Ерліха при профілактичній і терапевтичній імунізації вакциною представлено втабл 1 Таблиця 1 Профілактична ефективність Вакцина Заявлена Прототип Терапевтична ефективність КІЛЬКІСТЬ прищепле- КІЛЬКІСТЬ тварин без КІЛЬКІСТЬ прищепле- КІЛЬКІСТЬ тварин без них клітин, хЮ 5 1,2 1,0 пухлин, % 90,0 89,5 З даних табл 1 видно, що навіть при збільшенні КІЛЬКОСТІ прищеплених пухлинних клітин, профілактична ефективність аутовакцини забезпечує 100%-ну протипухлинну резистентність, а терапевтична ефективність збільшувалась ВДВІЧІ Приклад 2 Асцитні пухлинні клітини саркоми-37 від син них клітин, хЮ 5 1,2 1,2 пухлин, % 60,0 30,0 генної лінії мишей BALB/c тричі промивають стерильним фізіологічним розчином Для приготування 1 мл вакцини суспензію пухлинних клітин в КІЛЬКОСТІ 1,0x107 обробляють 1мл фільтрату культуральної рідини В subtihs 1MB В7025 Суміш шкубують в термостаті при 37°С 1 годину, періодично струшуючи Після закінчення інку 57869 бацм вакцину перевіряють на стерильність і життєздатність пухлинних клітин Виготовлену вакцину досліджують на протипухлинну активність При дослідженні профілактичної ефективності вакциною імунізують мишей лінії BALB/c Через 28 діб після імунізації мишам в черевну порожнину прищеплюють вірулентні пухлинні клітини саркоми-37 в КІЛЬКОСТІ 1,5x105 При дослідженні терапевтичної ефективності мишам лінії BALB/c прищеплюють 1,5x105 вірулентних пухлинних клітин саркоми-37 Через 24 години починають лікування вакциною Протипухлинну резистентність мишей до саркоми-37 при профілактичній і терапевтичній імунізації вакциною представлено втабл 2 Таблиця 2 Профілактична ефективність Вакцина Терапевтична ефективність КІЛЬКІСТЬ прищепле- КІЛЬКІСТЬ тварин без КІЛЬКІСТЬ тварин без "ел пухлин, % них клітин, хЮ 5 пухлин, % Заявлена 95,0 60,0 Прототип 1,0 88,9 1,0 50,0 З даних табл 2 видно, що профілактична і тена протипухлинну активність рапевтична ефективність аутовакцини, одержаної При дослідженні профілактичної ефективності заявленим способом, вища навіть при збільшенні вакциною олунізують мишей лінії BALB/c Через 28 дози прищеплених пухлинних клітин в 1,5 рази діб після імунізації мишам в черевну порожнину Приклад З прищеплюють вірулентні пухлинні клітини аденоПухлинну тканину сингенної лінії мишей карциноми Ерліха в КІЛЬКОСТІ 2,5x105 BALB/c з прищепленою солідною формою аденоПри дослідженні терапевтичної ефективності карциноми Ерліха тричі промивають стерильним мишам лінії BALB/c підшкірне прищеплюють фізіологічним розчином, подрібнюють Для приго5,0x105 вірулентних пухлинних клітин аденокарцитування 1мл вакцини беруть 1,0x107 пухлинних номи Ерліха Через 24 години починають лікуванклітин, обробляють 0,5мг лектину Суміш інкубуня вакциною ють в термостаті при 37°С 0,5 години, періодично Протипухлинну резистентність мишей до адеструшуючи Після закінчення інкубації вакцину нокарциноми Ерліха при профілактичній і терапевперевіряють на стерильність і життєздатність пухтичній імунізації вакциною представлено втабл З линних клітин Виготовлену вакцину досліджують "ел них клітин, хЮ 5 КІЛЬКІСТЬ прищепле Таблиця З Профілактична ефективність Заявлена Прототип Терапевтична ефективність КІЛЬКІСТЬ прищепле- КІЛЬКІСТЬ тварин без них клітин, хЮ 5 3,0 "ел Вакцина пухлин, % 100,0 50,0 З даних табл 3 видно, що профілактична і терапевтична ефективність аутовакцини, одержаної заявленим способом, збільшується в 2 рази Приклад 4 Асцитні пухлинні клітини саркоми-37 від сингенної лінії мишей BALB/c тричі промивають стерильним фізіологічним розчином Для приготування 1 мл вакцини суспензію пухлинних клітин в КІЛЬКОСТІ 1,0x107 обробляють пектином з розрахунку 0,06мг/мл Суміш шкубують в термостаті при 37°С 1 годину, періодично струшуючи Після закінчення інкубації вакцину перевіряють на стерильність і життєздатність пухлинних клітин Виготовлену вакцину досліджують на протипухлинну КІЛЬКІСТЬ прищепле них клітин, хЮ 5 5,0 5,0 КІЛЬКІСТЬ тварин без пухлин, % 80,0 55,0 активність При дослідженні профілактичної ефективності вакциною імунізують мишей лінії BALB/c Через 28 діб після імунізації мишам в черевну порожнину інокулюють вірулентні пухлинні клітини саркоми-37 в КІЛЬКОСТІ 2,5x105 При дослідженні терапевтичної ефективності мишам лінії BALB/c прищеплюють 1,5хЮ5 вірулентних пухлинних клітин саркоми-37 Через 24 години починають лікування вакциною Протипухлинну резистентність мишей до саркоми-37 при профілактичній і терапевтичній імунізації вакциною представлено втабл 4 Таблиця 4 Профілактична ефективність них клітин, хЮ 5 2,5 пухлин, % 100,0 100,0 Дані табл 4 підтверджують, що профілактична КІЛЬКІСТЬ прищепле них клітин, хЮ 5 "ел "ел Заявлена Прототип Терапевтична ефективність КІЛЬКІСТЬ прищепле- КІЛЬКІСТЬ тварин без "ел Вакцина КІЛЬКІСТЬ тварин без пухлин, % 80,0 40,0 і терапевтична ефективність вакцини, одержаної 57869 заявленим способом, зростає у 2 рази Таким чином, запропонований спосіб одержання протипухлинної аутовакцини дозволяє одержати вакцину зі значно вищою протипухлинною активністю Профілактична і терапевтична ефективність запропонованої вакцини ВДВІЧІ перевищує ефективність вакцини за способом - прототипом При цьому скорочується термін приготування з 1-2 годин до 0,5-1,0 години Значно зменшуються затрати на придбання поживного середовища, необхідного для одержання високоактивних продуктів метаболізму штам у-продуцента Спосіб не вимагає додаткового спеціального Комп'ютерна верстка Е Ярославцева 8 обладнання і може широко застосовуватися при одержанні протипухлинних аутовакцин Важливо ВІДМІТИТИ, що при дослідженні в експерименті одержана таким способом вакцина не чинила на організм тварин імунодепресивної дії та ніяких інших побічних ефектів Отже, висока ефективність і нешкідливість одержаної заявленим способом вакцини створює експериментальне обґрунтування для рекомендації впровадження и в клінічну практику для лікування радикально оперованих хворих з метою профілактики рецидивів і метастазів Підписано до друку 05 08 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна