Спосіб активації розвитку меристем та розмноження рослин цикорію коренеплідного

Корисна модель відноситься до галузі сільського господарства, зокрема до біотехнології, а саме методів селекції. Основним питанням при мікроклональному розмноженні є підбір живильного середовища для введення та розмноження апікальної меристеми рослин. При тривалому мікроклонуванні, у разі надлишку в середовищі біологічно активних речовин, в базальній частині пагона спостерігається проліферація калюсної маси. Це призводить до цитогенетичних відхилень у сформованих клонів і зниження коефіцієнта розмноження та інтенсивності розвитку біоматеріалу. Часто значні ускладнення викликає етап укорінення рослин отриманих через калюсну культуру. Для подолання цієї проблеми необхідно визначити для кожного виду, зокрема Cichorium intubus L. збалансований екзогенно-ендогенній комплекс поживних речовин та регуляторів росту рослин, який би забезпечував о тримання генетичне вирівняного матеріалу. Відомий спосіб для отримання калюсної тканини цикорію салатного, де застосовується живильне середовище Шенка - Хільдебрандта, яке містить високі концентрації регуляторів росту а уксинової природи [Schenk R.U., Hilderbrandt A.C., Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures,- Can. J. Bot., 1972, N 1. - P. 199-204.]. Проте при використанні середовища, яке включає 0,5мг/л 2,4дихлорфеноксиоцтової кислоти; 2,0мг/л парахлорфеноксиоцтової кислоти та 0,1мг/л кінетину органогенезу не відбувається. Відомий спосіб для мікроклонального розмноження рослин цукрових буряків [Редько B.I., Ільєнко I.I., Павловські Л.Л., Білоус В.О. Методичні рекомендації по мікроклональному розмноженню цукрових буряків. - Київ, 1997. - 10 с.], в якому культивування рослин проводять на агаризованому живильному середовищі, яке містить таке співвідношення компонентів,мг/л води: калій азотнокислий 2500,0, кальцій хлористий 150,0, магній сірчанокислий 250,0,амоній сірчанокислий 134,0, натрій фосфорнокислий, однозаміщений 150,0, залізо сірчанокисле 27,95, етилендіамінтетраацетат натрію 37,23, борну кислоту 3,0, марганець сірчанокислий 10,0, цинк сірчанокислий 2,0, калій йодистий 0,75, натрій молібденове кислий 0,25, мідь сірчанокислу 0,025, кобальт хлористий 0,025, аскорбінова кислота 1,0, нікотинова кислота 0,5, піридоксин - НСІ 0,1, тіамін - НСІ 0,1, L глютамін 1,0, гліцин 3,0, b-аланін 1,0, мезоінозит 100,0, 6-бензиламінопурин 0,1, сахароза 30000,0. Відомий спосіб має такі спільні суттєві ознаки з пропонованим: культивування рослин на агаризованому живильному середовищі, якісний склад інгредієнтів, окрім амонію азотнокислого, натрію фосфорнокислого однозаміщеного та гіберелінової кислоти. Але незважаючи на це недоліком даного середовища є низький відсоток формування пагонів, який не перевищує 21%, що не забезпечує отримання достатньої кількості клонованих рослин для залучення в подальші генетико-селекційні дослідження. Найбільш близьким за сукупністю ознак до запропонованої корисної моделі є спосіб депонування культур в умовах in vitro (п.№ 15085. МПК (2006) А01Н4/00), де культивування рослин проводять на агаризованому живильному середовищі, яке містить співвідношення компонентів, мг на 1л води: амоній азотнокислий 1650,0, калій азотнокислий 1900,0, кальцій хлористий 440,0, магній сірчанокислий 370,0,калій фосфорнокислий однозаміщений 170,0, залізо сірчанокисле 27,95, етилендіамінтетраацетат натрію 37,23, (сірчанокисле залізо в хелатній формі), борну кислоту 6,2, марганець сірчанокислий 22,3, цинк сірчанокислий 8,6, калій йодистий 0,83, натрій молібденове кислий 0,25, мідь сірчанокислу 0,025, кобальт хлористий 0,025, мезоінозит 100,0, гліцин 2,0, нікотинова кислота 0,5, тіамін 0,1, піридоксин 0,1 аскорбінова кислота 1,0, гіберелова кислота (гіберелінова кислота) 0,25, кінетин 0,1, нафтилоцтова 0,05-0,5 або індолілоцтоваамоній 0,2 або гетероауксин 0,2, сахароза 10000,0-40000,0. Відомий і запропонований способи мають спільні суттєві ознаки: культивування рослин проводять на агаризованому живильному середовищі, якісний склад інгредієнтів, окрім натрію фосфорнокислого однозаміщеного, кінетину, нафтилоцтової кислоти та спільні ознаки по кількісному вмісту складу інгредієнтів живильного середовища, окрім амонію азотнокислого, кальцію хлористого, аскорбінової кислоти, піридоксину, тіаміну, гліцину, гіберелінової кислоти (гіберелової кислоти). Відомий спосіб використовували для депонування рослин стевії, а запропонований спосіб для активації розвитку меристем та розмноження рослин цикорію коренеплідного. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб активації розвитку меристем та розмноження рослин цикорію коренеплідного шляхом використання поліпшеного живильного середовища, що дає змогу інтенсивно клонувати в культурі in vitro рослини цикорію коренеплідного генетичне ідентичних материнській рослині, що забезпечує скорочення біотехнологічного процесу і зменшує матеріальні затрати для його виконання. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі активації розвитку меристем та розмноження рослин цикорію коренеплідного, що включає культивування рослин на агаризованому живильному середовищі, яке містить амоній азотнокислий, калій азотнокислий, кальцій хлористий, магній сірчанокислий, залізо сірчанокисле, етилендіамінтетраацетат натрію, борну кислоту, марганець сірчанокислий, цинк сірчанокислий, калій йодистий, натрій молібденовокислий, мідь сірчанокислу, кобальт хлористий, аскорбінову кислоту, піридоксин; тіамін; нікотинову кислоту; гіберелінову кислоту, мезоінозит; гліцин; сахарозу. Згідно з корисною моделлю культивування рослин проводять на живильному середовищі яке додатково містить натрій фосфорнокислий однозаміщений, L-глютамін; b -аланін; 6-бензиламінопурин. Запропонована корисна модель має такі нові ознаки: по кількісному вмісту інгредієнтів - амонію азотнокислого містить 825,0мг/л, кальций хлористий 660мг/л, збільшений в 5 разів вміст аскорбінової кислоти 5мг/л, піридоксину 1,0мг/л, тіаміну - 1,0мг/л, гліцину - 3,0мг/л та додатково містить натрій фосфорнокислий однозаміщений 150мг/л, b-аланін; L-глютамін; 6-бензиламінопурин по 1,0мг/л. Використання запропонованого способу сприяє інтенсивному розмноженню рослин цикорію коренеплідного та отриманню в короткі терміни значно більшої кількості клонованих, генетичне ідентичних рослині донору експлантів матеріалів, і таким чином забезпечує скорочення біотехнологічного процесу та зменшує матеріальні затрати для його виконання. Проведенні досліди свідчать, що по прототипу вихід рослин з формованними генеративними пагонами складає 40% від загальної кількості висаджених, а при пропонованому способі дозволяє інтенсивно формувати генеративні пагони у 94% культивованого матеріалу. Згідно прототипу, утворення генеративних пагонів спостерігається через 20-25 діб, а кількість індукованих меристем не перевищує 21%, що значно подовжує процес отримання достатньої кількості клонованих рослин, при використанні пропонованого живильного середовища формування генеративних пагонів фіксуємо на 10-15 день, а кількість експлантів, які інтенсивно формують пагони збільшується до 96%. Таким чином, при використанні пропонованого живильного середовища в загальній селекційній схемі скорочується час та затрати праці на створення генетично-ідентичних форм з визначеними господарське цінними ознаками та дасть можливість отримати на їх основі нові селекційні матеріали. Результати досліджень наведені в таблиці. Таблиця Ефективність пагоноутворення Сорт Варіанти Кількість висадженого матеріалу Ум. 95 Ум. 97 Ум. 99 Ум. 95 Ум. 97 Ум. 99 Прототип 50 50 50 50 50 50 Пропонований спосіб Сформовані структури Пагони Калюс шт. 20 21 19 47 48 46 % 40,0 42,0 38,0 94,0 96,0 92,0 I. + + + +++ +++ +++ шт. 2 2 % 4,0 4,0 I. + + Матеріали, що не формували пагони шт. % 30 60,0 29 58,0 31 62,0 1 2,0 2 4,0 2 4,0 Примітка: дані таблиці подано в середньому за повторностями; І. - інтенсивність утворення структур; + - низька інтенсивність формування (пагонів, калюсу); ++ - середня інтенсивність формування (пагонів, калюсу); +++ - висока інтенсивність формування (пагонів, калюсу); Спосіб здійснюється наступним чином. Готують живильне середовище в яке послідовно вносять компоненти у наведених згідно способу що заявляється. Об'єм розчину доводять до 1 л, встановлюють рН -5,8. Середовище для клонування розливають у культуральні стаканчики або колби та автоклавірують при температурі 120 С протягом 20 хвилин (тиск 1,05атм).