Спосіб одержання живильного середовища для визначення токсигенності дифтерійних бактерій

Изобретение относится к медицине, а именно, к микробиологии, в частности, получению питательных сред для выращивания микроорганизмов. Уровень заболеваемости дифтерией в Украине остается относительно высоким, несмотря на проводимые профилактические санитарногигиенические и лечебные мероприятия. Высокая степень патогенности возбудителя дифтерии, приводящая к стремительному развитию тяжелого инфекционного процесса, побуждает к поиску новых или совершенствованию известных способов диагностики и оценки степени риска в зависимости от характеристик Corynebacterium diphtheriae. Используемые способы контроля распространения инфекции включают и такие лабораторные исследования как определение токсигенности бактерий дифтерии, выделяемых от заболевших и бактерионосителей. В частности, немалое значение имеет как можно более ранняя диагностика токсигенных штаммов C.diphtheriae в реакциях иммунопреципитации, а также изыскание возможности снижения стоимости питательных сред, используемых в таких исследованиях. Изложенные обстоятельства явились основанием для разработки нового способа получения плотной питательной среды из непищевого белкового сырья. Актуальность разработки нового способа получения такой среды основывается также на возникших в последние годы осложнениях в приобретении новых питательных сред, производимых в других странах. Известны различные прописи питательных сред для определения токсигенности штаммов C.diphtheriae в реакциях иммунопреципитации in vitro. Среди них такие как сывороточно-мальтозоацетатный агар (Луговая Л.В. Лаб. дело. - 1956. №4. - С.25); Хамачушкин В.В. К методике определения токсигенности микробов in vitro // Лаб. дело. - 1959. - №3. - С.39; Романов Г.В., Шнирсон А.Н.), фосфатно-пептонный агар для определения токсигенности дифтерийных культур (ЖМЭИ. 1956. - 12. - С.34 - 39); "Мартеновский агар для определения токсигенных свойств коринебактерий дифтерии", рекомендованный Приказом МЗ СССР, №450, 1986 "О мерах по предупреждению заболеваемости дифтерией"; среда ОТДМ Дагестанского НИИ питательных сред (Газизова Г.Р. Лабораторное дело. - 1990. - №7. - С.63 - 64). Общим недостатком перечисленных питательных сред является использование в качестве белковой основы мясных продуктов, а также необходимость добавления 20% нативной сыворотки животных, что при обширных эпидемиологических обследованиях значительно повышает их стоимость. Прототипом предлагаемой среды является питательный агар для определения токсигенности дифтерийных микробов (ОТДМ), который выпускается в форме сухой агаризованной среды. Состав ОТДМ: автолизат кильки - 17,5г; агар 12,0г; натрий фосфорнокислый двухзамещенный 0,25г; сода кальцинированная - 0,25г; pH 7,8 - 8,0. Способ приготовления: 30г порошка высыпать в колбу с 1л холодной дистиллированной воды, тща тельно перемешать, прокипятить 5 - 7мин., профильтровать, разлить по 17,0мл в стерильные пробирки, простерилизовать на водяной бане 30мин. Остудить до 45 - 50°C. Добавить по 3,5мл лошадиной сыворотки, разлить в стерильные чашки Петри. Недостатком этой среды является получение ее из пищевого сырья, дефицитности ее из-за разрыва связей после распада Союза, продолжительности сроков обнаружения токсигенных штаммов. В основу изобретения поставлена задача разработать способ получения плотной питательной среды для выделения токсигенных штаммов C.diphtheriae путем использования в качестве белковой основы отходов гаммаглобулинового производства и совокупности ряда факторов и воздействий, которые позволяют сократить сроки выявления токсигенных штаммов, заменить использование дефицитного сырья и удешеви ть стоимость питательных сред. Поставленная задача достигается путем использования в качестве белковой основы панкреатического перевара фракции IV, получаемой как побочный продукт гаммаглобулинового производства. В целях обогащения белковой основы углеводными компонентами проводится одновременное панкреатическое переваривание фракции IV и картофельного крахмала. Для создания условий оптимального токсинообразования проводится освобождение основы от Fe2+ путем добавления фосфатной смеси и вводится стимулятор токсинообразования трисоксиметиламинометан (ТОМАМ). В эксперименте было изучено влияние различных концентраций крахмала, 2-валентного железа и ТОМАМ на интенсивность токсинообразования дифтерийных бактерий in vitro. Для выяснения вопроса о влиянии концентрации крахмала на интенсивность токсинообразования C.diphtheriae in vitro опыт проводился следующим образом: в смесь, содержащую измельченную фракцию IV и бычью поджелудочную железу, вносили крахмал из расчета 0,2; 0,25; 0,30; 0,35; 0,40 и 0,45% крахмала. Образцы подвергали панкреатическому перевариванию при 45° в течение 72 часов с последующим кипячением и фильтрацией. Полученные перевары разводили дистиллированной водой до содержания аминного азота 160 - 180мг%, освобождали от ионов Fe2+, вносили 0,12% ТОМАМ, pH доводили до 7,0 - 7,2 0,1н HCl, агаризовали. Каждый образец делили на 4 части, в которые вносили 5,0; 10,0; 20,0 и 30,0% нормальной сыворотки крупного рогатого скота (НСКРС). Полученные среды, содержащие равные количества аминного азота и ТОМАМ, и различающиеся по количеству крахмала и НСКРС использовали для изучения зависимости токсинообразования C.diphtheriae от содержания крахмала и НСКРС. Определение токсигенности штаммов проводили по методу диск-диффузии, согласно Методическим рекомендациям по применению модифицированной среды Пизу и индикаторных бумажных дисков для идентификации, биохимического типирования и определения токсигенности дифтерийных бактерий (Фельдман Ю.М. и др. - М., 1988). Результаты этого опыта приведены в табл.1. Как видно из табл.1, оптимально линии преципитации образуются при содержании в исходной среде 0,3 - 0,35% крахмала. В данных условиях для обнаружения токсинообразования достаточно присутствия в среде 5% сыворотки. В присутствии более низких и более высоких концентраций крахмала линии преципитации получаются менее четкими и для их проявления требуется большее количество НСКРС. Проведенные опыты позволили установить количество крахмала, включение которого в процесс панкреатического переваривания обеспечивает оптимальное обогащение среды углеводными компонентами. Для изучения влияния концентрации Fe2+ на интенсивность токсинообразования C.diphtheriae in vitro на предлагаемой среде опыт был проведен следующим образом. Белковую основу доводили дистиллированной водой до содержания аминного азота 180мг%. В разведенной таким образом основе содержалось 2,25мкг/мл Fe2+ при определении методом Виноградовой И.Н. и др. (Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней. - Медгиз, 1962). Применяя различные количества фосфа тной смеси было осуществлено ступенчатое извлечение Fe2+ и были получены образцы с содержанием последнего: 0,25мкг/мл; 0,125мкг/мл; 0,06мкг/мл; 0,0мкг/мл. В каждую пробу было внесено 0,12% ТОМАМ. Таким образом, были получены образцы среды с одинаковыми характеристиками по аминному азоту и содержанию ТОМАМ и разным количеством Fe2+. Полученные среды агаризовали (по 100мл каждой). Каждый образец делили на 4 порции (по 25мл), в которые вносили 5, 10, 20 и 30% НСКРС. На каждом образце изучали токсинообразование in vitro. Как свидетельствуют данные, приведенные в табл.2, появление линий преципитации отмечается на средах, в которых содержание Fe2+ не превышает 0,06мкг/мл, а концентрация сыворотки составляет 20 и 30%. Максимальное токсинообразование отмечается при отсутствии обнаруживаемого Fe2+ в среде, причем появление линий преципитации обнаруживается при более низких концентрациях НСКРС (5 и 10%). Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее активное токсинообразование наблюдается при максимальном удалении ионов двухвалентного железа из питательной среды. Зависимость интенсивности токсинообразования C.diphtheriae от концентрации ТОМАМ изучалась в следующей постановке опыта. Белковую основу, полученную панкреатическим перевариванием смеси фракции IV и 0,32% картофельного крахмала, освобождали от Fe2+ осаждением фосфатной смесью и доводили дистиллированной водой до содержания аминного азота 180мг%. В 6 флаконов вносили по 100мл полученной жидкости и последовательно добавляли 0,05; 0,1; 0,12; 0,15; 0,20 и 0,25% сухого ТОМАМ. После растворения ТОМАМ pH устанавливали равным 7,0 - 7,2 0,1 н. HCl, и добавляли 2% агара и стерилизовали 20мин при 120° в автоклаве. Содержимое каждого флакона разливали в стерильные чашки Петри, в каждую из которых соответственно вносили 5, 10, 20 и 30% НСКРС. Таким образом, получали ряд сред, содержащих концентрации ТОМАМ в диапазоне 0,05 - 0,25% и НСКРС - 5 - 30,0%. Результаты, отражающие интенсивность токсинообразования в данных условиях, приведены в табл.3. Как видно из табл.3, токсинообразование С. diphtheriae удается зафиксировать в присутствии 5% сыворотки в диапазоне концентраций трисоксиметиламинометана 0,1 - 0,2%. Повышение концентрации НСКРС до 10% дает возможность усилить токсинообразование в пробах с содержанием ТОМАМ 0,1 - 0,12%. В остальных пробах сравнимая активность достигается только при прибавлении 20% НСКРС (0,15% ТОМАМ) и 30% (0,05 и 0,20% ТОМАМ). При концентрации ТОМАМ 0,25% добавление сыворотки не вызывает стимулирования токсинообразования. Таким образом, оптимальной признана концентрация ТОМАМ 0,10 - 0,12%, при которой было достигнуто наиболее активное токсинообразование при содержании сыворотки более низком (10%), чем в остальных случая х (20 30%). Результаты, полученные в описанных экспериментах, позволили принять следующие параметры при конструировании среды для определения токсинообразования C.diphtheriae: содержание крахмала - 0,30 - 0,35% содержание двухвалентного железа – 0 содержание ТОМАМ - 0,10 - 0,12% Способ приготовления питательной среды проводится в два этапа: I. Приготовление белковой основы для питательной среды; II. Приготовление плотной питательной среды для определения токсигенности. Способ приготовления белковой основы 300г фракции IV (свежеполученной или замороженной) заливают 1л дистиллированной воды, доводят до кипения и кипятят при средней интенсивности 30мин. Жидкость сливают, осадок охлаждают воздушным охлаждением и дважды пропускают через мясорубку. Из полученного фарша готовят 10% суспензию на дистиллированной воде. Для этого отвешивают на технических весах по 100г фарша, помещают в четверти, в которые вливают по 1л дистиллированной воды, подогретой до 50°. В приготовленную суспензию добавляют картофельный крахмал из расчета 0,3 - 0,35% (3,0 3,5г на 1л суспензии) и вносят свежую или консервированную хлороформом бычью поджелудочную железу (80г свежей или 100г консервированной на 1л суспензии) и 1% хлороформа (10мл на 1л). pH смеси устанавливают равным 7,8 - 8,0 путем добавления 20% NaOH. Смесь плотно закрывают резиновой пробкой и помещают в термостат при 40 - 45°C. Через 24 часа pH смеси подводят 7,8 - 8,0; через 48 часов смесь встряхивают. Через 72 часа смесь становится прозрачной, ее кипятят 5 - 10мин для инактивации фермента, фильтруют через бумажный фильтр "красная лента" и стерилизуют в автоклаве 30мин при 120°. Полученная белковая основа имеет характеристики, приведенные в табл.4. II. Приготовление питательной среды для определения токсигенности Процесс приготовления питательной среды на полученной основе включает освобождение от ионов Fe2+ и введение стимулятора токсинообразования ТОМАМ, агаризацию и внесение НСКРС. Для освобождения от ионов двухвалентного железа используют фосфатную смесь, состоящую из таких компонентов: Na2HPO4 12H2O - 10г, KH 2PO4 - 2г, H2 O - 100мл и 10% CaCl 2. К 1л белковой основы прибавляют 50мл фосфа тной смеси и 4мл 10% CaCl2, выдерживают при комнатной температуре 30 - 40мин. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при 6000g в течение 10 15мин. Освобожденную от ионов Fe2+ основу разбавляют дистиллированной водой до концентрации аминного азота 160 - 180мг%, добавляют 0,12 - 0,14% ТОМАМ (1,2 - 1,4 г сухого вещества на 1л) и 2% агара. Среду стерилизуют 20мин при 120°. Перед использованием вносят 8,0 - 10,0% НСКРС. Пример 1. 150г свежеполученной фракции IV залили 1,5л дистиллированной воды, довели до кипения и кипятили 30мин при средней интенсивности. Жидкость слили, осадок охладили воздушным охлаждением и пропустили дважды через мясорубку. На технических весах взвесили 100г полученного фарша, поместили в колбу, прилили 1л дистиллированной воды, нагретой до 50°. В приготовленную суспензию добавили 3,0г картофельного крахмала, внесли 80г свежей бычьей поджелудочной железы и 10мл хлороформа. pH смеси установили 7,9 добавлением 20% NaOH, затем плотно закрыли резиновой пробкой и поместили в термостат при 45°. Через 24 часа pH смеси сдвинулся в кислую сторону (7,0) и был подведен до 7,9 20% NaOH. Через 48 часов смесь несколько раз встряхнули. Через 72 часа смесь стала прозрачной, ее прокипятили 10мин и отфильтровали через бумажный фильтр "красная лента" с последующей стерилизацией в автоклаве 20мин при 120°C. Полученная основа была проанализирована на содержание общего, аминного, безбелкового аминного азота, триптофана и Fe2+. Эти показатели соответственно составили 787,0; 353,0; 44,0мг%; 2,46мкг/мл и 2,96мкг/мл. Для освобождения от ионов Fe2+ к 0,5л полученной основы добавили 25,0мл фосфатной смеси и 2,0мл 4% CaCl2, выдержали при комнатной температуре 35мин. Образовавшийся осадок отделили центрифугированием при 6000g и замеряли объем полученной жидкости (450мл). Основу, освобожденную от ионов Fe2+, разбавили дистиллированной водой до содержания аминного азота 180мг%, соотношение объемов основы и дистиллированной воды рассчитывали по правилу смешения: Всего получено: 432,5 + 450 = 785,5мл среды, освобожденной от Fe2+. Среду разлили в флаконы объемом 100мл по 50мл в каждый. В каждый флакон внесли 60мг сухого трисоксиметиламинометана (ТОМАМ) довели до полного растворения помешиванием стеклянной палочкой и добавили 1% агара. Среду простерилизовали 20мин при 120°, охладили до 45°, после чего в один флакон внесли 5,0мл НСКРС и разлили в стерильные чашки Петри. Остальные флаконы хранили до использования при комнатной температуре. Полученные чашки Петри со средой были использованы для изучения токсинообразования 7 штаммов C.diphtheriae по общепринятой методике, выделенных от носителей токсигенных коринебактерий и больных дифтерией, которые были получены из Харьковской областной СЭС. Из них через 18 - 24 часа образование линий преципитации было зафиксировано у 6 штаммов. Один штамм образовал линии преципитации через 48 часов. Пример 2. 120г замороженной фракции IV залили 1200мл дистиллированной воды, довели до кипения и кипятили 30мин при средней интенсивности. Жидкость слили, обработку осадка с целью получения белковой основы проводили с соблюдением соотношений и последовательности, изложенных в примере №1, но взятое количество крахмала составило 3,5г/л. Полученная в данном примере основа характеризовалась следующими показателями: азот общий - 980мг%; азот аминный 325мг%; безбелковый аминный азот 43мг%; триптофан 3,08мкг/мл; Fe2+ 4,0мкг/мл. Приготовление питательной среды на полученной белковой основе проводилось аналогично примеру 1, но количество внесенного стимулятора токсинообразования ТОМАМ составило в данном случае 50мг на 50мл, т.е. 0,1%. На данной среде было изучено токсинообразование 16 штаммов от больных дифтерией и носителей токсигенных коринебактерий, которые были получены из Харьковской областной СЭС. Через 18 - 24 часа линии преципитации были обнаружены у 13 штаммов. Остальные 3 штамма дали линии преципитации через 48 часов. Для сравнительного изучения питательной среды, получаемой по предлагаемому способу, и коммерческой были использованы токсигенные штаммы, выделенные от 37 больных дифтерией и бактерионосителей. Об интенсивности токсинообразования судили по времени образования линий преципитации на стандартной и предлагаемой среде в присутствии различных количеств сыворотки крупного рогатого скота (табл.5). Как следует из приведенных в табл.5 данных, добавление различных количеств (от 5 до 30%) НСКРС в предлагаемую и контрольную (ОТДМ) среды показало, что при добавлении 20 - 30% сыворотки как в предлагаемую, так и контрольную среду существенных различий не выявлено. Добавление 5,0 - 15,0% сыворотки через 1 сутки дает возможность сократить сроки определения токсигенных свойств коринебактерий дифтерии в 1,5 - 2 раза по сравнению с контрольной средой. Так при добавлении 1% сыворотки через 24 часа На предлагаемой среде линии преципитации по отношению к дифтерийному антитоксину (дисковый метод) выявились у 54,1% штаммов, в то время как при использовании контрольной среды - 5,4%. Через 48 часов на предполагаемой среде при добавлении того же количества сыворотки линии преципитации выявились у 78,4% изученных штаммов, тогда как на коммерческой - 10,8%. Уменьшение количества добавляемой сыворотки до 5% позволило на предлагаемой среде обнаружить преципитационную активность через 24 часа у 48% штаммов С. diphtheriae, через 48 часов у 67,5% штаммов, в то время как на коммерческой среде линии преципитации отсутствовали, что не позволяет выявить штаммы с токсигенными свойствами. Таким образом, предлагаемая среда по сравнению с коммерческой позволяет сократить сроки выявления токсигенных свойств в 1,5 - 2 раза при уменьшенном добавлении НСКРС в 2 раза и увеличить число положительных находок в 5 - 10 раз.