Спосіб консервування еритроцитів

Изобретение относится к криобиологии, а именно низкотемпературному консервированию эритроцитов человека, и может быть использовано на станциях переливания крови. Наиболее близким к заявляемому является способ консервирования эритроцитов с использованием криопротектора 1,2-пропандиола (1,2ПД). Согласно этому способу эритромассу смешивают 1 : 1 с криоконсервантом, содержащим 35% 1,2ПД, 3% сахарозы, 0,6% хлорида натрия и воду бидистиллированную. Замораживают со скоростью 12 - 14°/мин до (-150) - (-170)°C, после чего погружают в жидкий азот. Недостатком этого способа является то, что эритроциты можно сохранять для переливания в ресуспендирующей среде не более 24 часов. В основу изобретения поставлена задача создания такого способа консервирования эритроцитов, в котором за счет изменения концентрации криопротектора и соотношения добавления его к эритромассе можно было бы снизить осмотическое давление, оказываемое окружающей средой на клетку на этапах замораживания - отогрева, и тем самым увеличить срок их хранения до 4 - 6 суток. Поставленная задача решается тем, что в способе криоконсервирования эритроцитов, включающем добавление к эритромассе криоконсерванта, содержащего 1,2ПД, сахарозу, хлорид натрия и воду бидистиллированную, и замораживание со скоростью 12 - 14°/мин до (-150) - (-170)°C с последующим погружением в жидкий азот, используют криоконсервант с содержанием 1,2-пропандиола 45 - 75мас.%, а криоконсервант добавляют в соотношении эритромасса : криоконсервант 1 : (0,3 - 0,7) до конечной концентрации 1,2ПД в суспензии 25 - 29%. Заявляемый способ осуществляют следующим образом. Эритроциты центрифугир уют при 2000об/мин в течение 20 - 25мин, удаляют надосадок и к эритромассе в соотношении 1 : (0,3 - 0,7) добавляют криоконсервант, содержащий: 1,2ПД 45 - 75% Сахароза 2 - 5% NaCl 0,3 - 0,9% Вода бидистиллированная Остальное Суспензию замораживают со скоростью 12 - 14°/мин до (-150) - (-170)°C, после чего переносят в жидкий азот. Отогревают сначала со скоростью 10°/мин до (-100) - (-120)°C, затем переносят в водяную баню (41 45)°C и отогревают до комнатной температуры. После отмывки переносят в раствор 8в, где хранят в течение 4 - 6 суток. Пример 1. Эритроциты человека центрифугировали при 2000об/мин в течение 20мин и удаляли надосадок. К эритромассе добавляли растворы криоконсервантов до различных конечных концентрация 1,2ПД. Содержание сахарозы в криоконсерванте - 4%, NaCl - 0,6%. Суспензии замораживали со скоростью 12°/мин до -170°C и переносили в жидкий азот. Отогревали со скоростью 10°/мин до -110 ± 10°C, переносили в водяную баню (43 ± 2°C) и отогревали до комнатной температуры. После отогрева отмывали растворами №1 (10% сахарозы, 1,6% NaCl, остальное вода бидистиллированная) и №2 (5% сахарозы, 0,9% NaCl, остальное - вода бидистиллированная). Отмытые эритроциты переводили в раствор 8в (1 : 1). Конечную концентрацию 1,2ПД в надосадке определяли методом ЯМР, точность оценки ±1%. Сохранность эритроцитов определяли по гемолизу. Результаты представлены в табл.1 (n = 6). Из табл.1 видно, что при конечной концентрации 1,2ПД в суспензии 25 - 29% гемолиз через 6 суток хранения в 1,5 - 2 раза меньше, чем в прототипе. Общие потери при этом не возрастают. Пример 2. Способ осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что конечная концентрация 1,2ПД в суспензии была постоянной (26 ± 1%), а изменяли концентрацию 1,2ПД в криоконсерванте и количество добавляемого криоконсерванта на 100мл эритромассы. Содержание сахарозы - 4%, NaCl - 0,6%. Результаты представлены в табл.2 (n = 6). Из табл.2 видно, что на 4 - е сутки хранения сохранность клеток в 2 раза выше, чем в прототипе, при использовании 1,2ПД в концентрации 45 - 75% и добавлении криоконсерванта к эритромассе в соотношении эритромасса : криоконсервант 1 : (03 - 07). При концентрации 1,2ПД выше 75% возрастают общие потери. Таким образом, заявляемый способ обеспечивает сохранность эритроцитов в ресуспендирующей среде в течение 4 - 6 суток. В ряде случаев, в зависимости от донора, сроки хранения криоконсервированных эритроцитов после отмывки и ресуспендирования в растворе 8 в достигали 11 дней (гемолиз 0,8%). Хранение при -80°C в течение 3 месяцев эритроцитов, консервированных заявляемым способом и способом по прототипу, показало, что в первом случае общие потери меньше (1,2 ± 1%), чем во втором (15,4 ± 1,3%), а после отогрева, отмывки и ресуспендирования в среде 8в первые пригодны для переливания (гемолиз 0,9 ± 0,2%), вторые не пригодны (гемолиз 1,5 ± 0,2%). Добавление криоконсерванта в соотношении 1 : (0,4 - 0,5) является наиболее оптимальным, т.к. такое количество легко отмерить по используемым сейчас в службе крови флаконам (50мл на эритромассу из одного флакона объемом 250мл или 0,5 от объема эритромассы), и при этом достигается концентрация 1,2ПД в надосадке 25 - 28%). При одинаковых объемах используемого криоконсерванта заявляемый способ позволяет законсервировать в 2 - 2,5 раза больше эритромассы, чем прототип. За счет добавления меньших объемов криоконсерванта экономится 15 - 30% реактивов и в 2 - 2,5 раза снижаются затраты на приготовление, хранение и транспортировку криоконсерванта, заготовку посуды и ее стерилизацию.