Імуногістохімічний спосіб експертизи м`яса і продуктів забою птиці на контамінацію сальмонелами

Імуногістохімічний спосіб експертизи м'яса і продуктів забою птиці на контамінацію 3 G проти сальмонели) на 20-30 хвилин. Зрізи знову промивають фосфатно-сольовим буфером і наносять 0,02см3 антивидового кон'югату (козячі антикролячі імуноглобуліни G, мічені пероксидазою хрону) на 20-30 хвилин. Після промивання зрізів буфером на них двічі наносять 0,1см3 діамінобензидину з метою візуалізації антигенів збудника і витримують протягом 5-10 хвилин. Після промивання дистильованою водою зрізи забарвлюють розчином гематоксиліну протягом 2-5 хвилин, знову промивають дистильованою, а потім водопровідною водою. Обробляють зрізи 96° етиловим спиртом і ксилолом. На останньому етапі наносять краплю полістиролу і накривають зрізи покривним склом. Порівняльний аналіз запропонованого способу та відомого прототипу показує, що спосіб відрізняється від існуючого чутливістю та конкретною спрямованістю. При застосуванні цього способу можна досліджувати органи і тканини птиці на сальмонелоносійство, що відповідає критерію "Новизна". Приклад 1 Отримання поліклональних антитіл Для розробки імуногістохімічного способу з метою діагностики м'яса і продуктів забою птиці на контамінацію сальмонелами, застосовували кролів вагою до 2-х кілограмів. Процес виготовлення поліклональних антитіл складався з декількох етапів: гіперімунізації кролів, отримання сироватки крові кролів, виділення імуноглобуліну класу G. Для гіперімунізації готували суспензію з наступних складових: 1см3 сальмонельозного антигену, 19см3 фосфатно-сольового буферу, 0,6см3 диметилсульфаксиду (димексиду). Доза становила 3см3/кг живої ваги (1см3 утримував 500тис. бактеріальних клітин). Кожну тварину гіперімунізували в крайову вушну вену, дотримуючись наступної схеми: 1-а ін'єкція-0,5см3 суспензії з димексидом; 2-а ін'єкція-через 4-5 діб 0,7см3 без димексиду; 3-я ін'єкція-через 4-5 діб 1см3 без димексиду Через 5-10 діб після останньої ін'єкції перевіряли результат гіперімунізації в кровокрапельній реакції аглютинації на наявність антитіл. В пробах від усіх кролів одержано позитивні результати. Кролів знекровлювали. Кров відбирали у стерильні пробірки і відстоювали у термостаті протягом 1,5 години за температури 37°С. Потім розміщували в холодильнику за температури +4°С на 12 годин. Після чого стерильними пастерівськими піпетками сироватку відбирали у стерильні флакони. Синтез кон'югату пероксидази хрону з IgG проводили за методом Накане. Приклад 2 Зараження курчат Salmonella enteritidis Для проведення досліджень було сформовано дві групи курчат по 50 голів у кожній. Першу групу курчат (дослідну) заражали орально суспензією Salmonella enteritidis за допомогою приєднаного до шприца гнучкого катетеру у дозі 0,2см3 на тварину (1×105 мікробних тіл на тварину). Для цього 26855 4 використовували штам S.enteritidis дикого типу - М №8. Штам культивували на звичайному МПА, режим культивування 48 годин за температури 37°С. Культуру змивали з агару 0,9% стерильним фізіологічним розчином. Готували суспензію з концентрацією 5×105 (500000) мікробних тіл в 1см3 у відповідності з оптичними стандартами мутності. Робоче розведення готували на стерильному МПБ. Друга група курчат - контроль (інтактна птиця). Для проведення другої серії дослідів було сформовано також дві групи курчат по 35 голів у кожній. Зараження проводили внутрішньом'язево тією ж суспензією, але у дозі 0,1см3 на тварину. Курчат забивали на 5-у, 8-у, 10-у, 13-у, 15-у, 17-у, 21-у та 51-у добу після зараження (в першій серії дослідів) та на 15-у, 30-у і 45-у добу (у другій серії дослідів). Від курчат відбирали шматочки м'язів та печінки. Органи фіксували у забуференому формаліні з подальшим виготовленням гістологічних препаратів. Приклад 3 Випробування запропонованого способу в лабораторних умовах Перед проведенням реакції проводили розведення компонентів реакції. Спочатку розводили видовий кон'югат (кролячі імуноглобуліни G). Для чого до 0,001см3 видового кон'югату додавали 2см3 0,9% стерильного фізіологічного розчину. Потім розводили антивидовий кон'югат (козячі антикролячі імуноглобуліни G мічені пероксидазою хрону) розчинником для антитіл (Antibody diluent) До 0,001см3 антивидового кон'югату додавали 0,2см3 розчиннику для антитіл. Після цього проводили розведення діамінобензидину (DAB), для чого до 0,02см3 DAB додавали 1см3 субстратного DAB буферу. Наступним етапом після процедури розведення компонентів було проведення самої імуногістохімічної реакції, яка описана вище. Запропонований спосіб імуногістохімічної діагностики прихованого сальмонелоносійства курей є новим та ефективним. Його можна рекомендувати для впровадження у практику ветеринарної медицини (діагностичних лабораторій ветеринарної медицини).