Спосіб культивування вірусів коксакі в

Корисна модель відноситься до області вірусології і може використовуватися для отримання ізолятів вірусів Коксакі В від людей (з діагностичною метою, і для оцінки інтенсивності циркуляції вірусів серед населення) та з об'єктів довкілля (води різного виду користування). Відомий спосіб одержання ізолятів вірусів Коксакі В шляхом їх культивування на перещеплювальних культурах клітин НЕр-2 (клітини епідермоїдної карциноми людини), Неlа (клітини раку шийки матки), KB (клітини епідермоїдного раку ротової порожнини), HLS (клітини ліпосаркоми людини), FL (клітини амніотичної оболонки людської плаценти) не дозволяє віддиференціювати зазначені віруси від інших ентеровірусів [1, 2]. В основу корисної моделі поставлено завдання розширити спектр перещеплювальних клітинних ліній для виділення вірусів Коксакі В та одночасного проведення їх диференціації з іншими ентеровірусами. Поставлене завдання вирішують шляхом культивування вірусів Коксакі В на перещеплювальній клітинній культурі НГУК-1 (клітини невриноми гассерова вузла пацюка) [3]. Приклад 1. Здійснення способу. Для здійснення способу беруть штами вірусів Коксакі В-1 (№1202, виділений із фекалій здорової дитини, м. Харків) та Коксакі В-3 (№1206, виділений із фекалій хворого на серозний менінгіт, м. Одеса) із музею патогенних для людини мікроорганізмів. Штами підтримують пасажами на культурі клітин НЕр-2. Культивування здійснюють в умовах термостату при температурі 37°С та вологості повітря 40-70%. Для інфікування вірусами Коксакі В використовують пробірочні культури клітин НГУК з моношаром, що сформувався за 48 годин їх культивування. З метою контролю зазначеними вірусами інфікують культуру клітин НЕр-2. Для вирощування перещеплювальної культури клітин НГУК-1 використовують поживне середовище RPMI1640 з додаванням 10% ембріональної сироватки великої рогатої худоби. Усі операції із зараження культур клітин здійснюють у захисному укритті (клас 2 безпеки). Після видалення середовища росту у пробірки з клітинним моно шаром вносять по 0,2мл вірусної суспензії (по 4 пробірки на кожний вірус) та 0,8мл середовища підтримки росту, яке відрізняється від середовища росту вмістом ембріональної сироватки великої рогатої худоби (2%). Пробірки інкубують у стаціонарному положенні під кутом 5 при 37°С. Культури щоденно мікроскопують, слідкуючи за появою цитопатогенного ефекту (ЦПЕ). Розвиток ЦПЕ в культурі клітин НГУК- 1 на рівні 75% клітин визначається на 3-7 добу. Приклад 2. Визначення ефективності способу. Ефективність способу визначають за розвитком ЦПЕ при порівняльному дослідженні чутливості культури НГУК-1 до ентеровірусів різних груп: двох зазначених вище штамів вірусів Коксакі В; вакцинного поліовірусу типу 3 (Leon 12a1b) - еталонний штам, отриманий із Референс-центру з діагностики поліомієліту (Росія, Москва); ЕСНО-6 - штам №1204, виділений з ліквору хворого на серозний менінгіт, м. Київ; ЕСНО-30 - штам №1205, виділений із носопролигового змиву хворого на серозний менінгіт, м. Київ. До початку дослідження штам поліовірусу типу 3 підтримують пасажами на культурі клітин НЕр-2, штами вірусів ECHO - на культурі клітин RD. При визначенні ефективності способу паралельно ставлять контролі вірусу на культурах клітин, зазначених вище, які є чутливими до даних вірусів. Облік результатів проводять лише за умови відповідності контролів очікуваним результатам. Результати дослідження надані в таблицях 1 та 2. Таблиця 1 Результати дослідження адаптації ентеровірусів до перещеплювальної клітинної культури НГУК-1 Тип вірусу 1 Коксакі В-1 Коксакі В-3 ЕСНО-6 ЕСНО-30 Поліовірус типу 3 Примітки: - відсутність ЦПЕ на культурі клітин; + наявність ЦПЕ на культурі клітин. Номер пасажу 2 + + 3 + + Таблиця 2 Результати дослідження ЦПЕ ентеровірусів на чутливих перещеплювальних клітинних культурах Вид культури клітин НЕр-2 НЕр-2 RD RD НЕр-2 Тип вірусу Коксакі В-1 Коксакі В-3 ЕСНО-6 ЕСНО-30 Поліовірус типу 3 1 + + + + + Номер пасажу 2 + + + + + 3 + + + + + Примітки: - відсутність ЦПЕ на культурі клітин; + наявність ЦПЕ на культурі клітин . Таким чином, запропонований корисною моделлю спосіб культивування вірусів Коксакі В дозволяє здійснювати диференціацію цих вірусів з поліовірусами та вірусами ECHO без застосування коштовних специфічних діагностичних сироваток. Література: 1. Ворошилова М.К., Жевандрова В.И., Балаян М.С. Методы лабораторной диагностики энтеровирусных инфекций. - М.: Медицина, 1964. - 152с. 2. Руководство по вирусологическим исследованиям полиомиелита // Глобальная программа по вакцинации и иммунизации. РПИ. ВОЗ. -Женева.: Москва, 2005. - 112с. 3. Авцын А.П., Кондакова Л.И., Халанский А.С., Полякова Г.П., Чудиновская Н.В. Новая клеточная линия невриномы гассерова узла крысы НГУК-1 // Цитология. - 1989. - Т. XXXI, №1. - c.97-101.