Спосіб визначення механічних пошкоджень кріоконсервованих клітин

Изобретение относится к криобиологии. Наиболее близким к заявляемому является способ определения механических повреждений криоконсервированных органов путем регистрации акустической эмиссии (АЭ) в ультразвуковом диапазоне, которая возникает в органе в результате его повреждения [1]. Недостатком способа является то, что он не позволяет получать достоверную информацию в случае определения повреждений клеток в суспензиях. Это обусловлено тем, что АЭ в суспензиях клеток при охлаждении регистрируется во всем температурном диапазоне ниже 00С, вплоть до – 1960С. Она возникает в момент начала кристаллизации льда и монотонно возрастает по мере понижения температуры. При этом трудно вычислить температурный диапазон АЭ, в котором происходит повреждение клеток. Задачей изобретения является повышение достоверности определения механических повреждений криоконсервированных клеток в суспензиях. Поставленная задача решается тем, что в способе определения механических повреждений криоконсервированных клеток, согласно изобретению, путем регистрации физических параметров регистрируют возникновение электрических импульсов в суспензии клеток. Способ осуществляют с помощью устройства, схема которого изображена на фиг. 1. Устройство включает контейнер 1, в котором находится суспензия 2 исследуемых клеток и емкостной зонд 3, погруженный в суспензию 2. Зонд 3 соединен с регистратором 4 электрических импульсов, в качестве которого может быть использован осциллограф. Примеры осуществления способа. Пример 1. 5 мл донорской крови человека, стабилизированной гемоконсервантом ЦОЛИПК - 76, центрифугировали, отделяли плазму. Полученную эритромассу смешивали в соотношении 1:1 скриоконсервантом, содержащим 35% 1,2-пропандиола, 3% сахарозы и 0,7% NaCl 1 мл этой смеси помещали в контейнер 1 и охлаждали до –1960С погружением в жидкий азот. Скорость охлаждения – 1000/мин, нагрева – 700/мин, В температурном диапазоне от – 1100С до –1640С, т.е. от температуры стеклования криозащитного состава, на осциллографе наблюдали импульсные сигналы зонда, возникающие в момент образования электрических зарядов в процессе механических разрушений твердоаморфной матрицы. Пример 2. Эритроциты, приготовленные по выше описанной методике, смешивали с пропандиосахаролем (ПДС) в отношении 1:1 и криозащитной средой на основе глицерина (60 мас. % глицерина, 40 мас. % Н2O) в отношении 2:1, т.е. две части эритромассы смешивали с одной частью раствора глицерина. Криозащитные среды выбирали таким образом, чтобы наличие электрических импульсов в них в температурном диапазоне tд (-196)0С существенно отличалось. 1 мл полученной смеси помещали в стакан и охлаждали до – 1960С (5), затем нагревали до температуры стеклования, и снова охлаждали до – 1960С. Циклирование в температурном интервале - 196°С проводили до 20 раз. Температура стеклования для суспензии эритроцитов с ПДС составляла -1100С, а для суспензии эритроцитов с раствором глицерина - (-108)0С. После размораживания в водяной бане (+450С) образцы центрифугировали и определяли свободный гемоглобин в надосадке. На фиг. 2 представлена зависимость содержания свободного гемоглобина от количества циклов охлаждения и нагрева в указанном диапазоне. При температурном циклировании эритромассы в присутствии ПДС зарегистрировано существенно меньше электрических импульсов, чем в таком же эксперименте, где криопро-тектором служит водный раствор глицерина. Как видно из результатов, приведенных на фиг. 2, с ростом количества циклов охлаждения и нагрева в температурной зоне tд (- 196)0С увеличивается содержание свободного гемоглобина в надосадке, т.е. растет гемолиз. Этот факт как раз и указывает на повреждение эритроцитов в результате термического воздействия. Гемолиз эритроцитов в криозащитном растворе с глицерином нарастает быстрее (фиг. 2, линия 2), чем в криозащитном растворе с ПДС (фиг. 2, линия 1). Отличия в количестве зарегистрированных электрических импульсов коррелируют с данными по гемолизу. Такие же импульсы мы наблюдали в растворах криопротекторов тех же концентраций после смешивания криозащитных сред с эритромассой. При этом импульсы возникали в растворах криопротекторов в тех же температурных интервалах, что и в суспензиях эритроцитов с добавками криопротекторов вблизи температуры стеклования. Отсюда можно сделать вывод, что в застеклованных микроучастках эритромассы возникают растрескивания, вызывающие электрические поля, которые затем наводят сигналы на зонде. Именно в этом диапазоне температур возникают повреждения, что видно по нарастанию гемолиза. Таким образом, из всей совокупности механических повреждений, выделяются только те, которые приводят к повреждению клеток в области низких температур.