Спосіб визначення енергетичного обміну при експериментальному хламідіозі

Спосіб визначення енергетичного обміну при експериментальному хламідюзі шляхом аналізу біологічного матеріалу, який відрізняється тим, що за біологічний матеріал використовують гомогенати печінки мишей лінії СВА, а енергетичний обмін оцінюють полярографічним методом Винахід відноситься до біохімії, а більш конкретно - до мембранологм, і може бути використаний у експериментальній медицині задля вивчення особливостей енергетичного метаболізму хазяїна за наявністю внутрішньоклітинних паразитів, наприклад, при хламідійній інфекції ВІДОМІ роботи, в котрих вивчалися різні аспекти енергетичного метаболізму інфікованих хламідіями клітинних суспензій (Hatch G М , McClarty G Cardiohpm remodeling in eukaryotic cells infected with Chlamydia trachomatis is linked to elevated mitochondnal metabolism // Biochem Biophys Res Commun - 1998 - V213, N 2, P 356-360, Gill S , Stewart R В Glucose requirements of L cells infected with Chlamydia psittacci//Can J Microbiol 1970 -V 16, N 10 -P 997-1001) Відомо також, що проблема порівняльного споживання кисню культурами клітин, нормальними та інфікованими хламідіями, вивчалася манометричним методом (Gill S , Stewart R В Effect of metabolic inhibitor on the production of Chlamydia psittaci by infected L cells//Can J Microbiol -1970 - V 16, N 11 - P 1079-1085), Споживання кисню є основною характеристикою інтенсивності енергетичного обміну, при цьому як біологічний матеріал досліджували культуру клітин Зазначений спосіб визначення основних дихальних характеристик хазяїна при хламідійній інфекції - найбільш близький до запропонованого за технічною суттю, здобутому результату - і був обраний нами за прототип Основним недоліком відомого способу оцінки параметрів енергетичного обміну хазяїна при хламідійній інфекції виявляється злипання інфікованих клітин у конгломерати, що робить неможливим точний облік споживаного кисню на життєздатну клітину Окрім того, спосіб, який ми взяли за про тотип, потребує значного об'єму біологічного матеріалу - клітинної біомаси, що пов'язане зі значними фінансовими витратами і з технічною складністю здобування великих об'ємів клітинної культури, інфікованої хламідіями До основи винаходу покладена задача підвищення точності оцінки впливу хламідій на енергетичний метаболізм хазяїна шляхом визначенням параметрів енергетичного обміну Задача, покладена до основи винаходу, вирішується тим, що у відомому способі визначення енергетичного обміну при експериментальному хламідюзі, аналізом біологічного матеріалу, згідно з винаходом, як біологічний матеріал використовують гомогенати печінки мишей лінії СВА, який досліджують полярографічним методом Підвищення точності способу оцінки енергетичного обміну при експериментальному хламідюзі за допомогою полярографічного аналізу досягається завдяки тому, що при використанні гомогенатів печінки мишей відтворюються більш фізіологічні умови експерименту зберігаються ендогенні регулятори і уся популяція мітохондрій, в тому числі й легка фракція, котру можна втратити при препаративному виділенні ДОЦІЛЬНІСТЬ використання для досліджень гомогенатів печінки замість ізольованих мітохондрій додатково пов'язана з необхідністю отримати достатню КІЛЬКІСТЬ матеріалу, оскільки для зараження урогенітальними штамами хламідій, які не мають високої контапозності, відбирають молодих тварин Задля виділення мітохондрій печінки мишей дослідної групи доводиться з'єднувати з-за низької ваги, що неминуче призводить до нівеліровки індивідуальних різниць Полярографічний метод вивчення дихання має ряд достоїнств високу чутливість ([02]=5х х Ю 9 моль/л), більш короткі строки інкубації із ме 42170 ншою КІЛЬКІСТЮ тканини, ніж, наприклад, при манометричному вимірюванні, менш громіздка технічна частина, котра дозволяє досліджувати більшу КІЛЬКІСТЬ проб одного зразка тканини, можливість повторних вимірювань Головна принципова відзнака та перевага полярографічного методу - можливість починати вимірювання без усякого латентного періоду, а саме у початковий період інкубації спостерігається особливо різке падіння параметрів, які звичайно виміряють задля оцінки окислювального фосфорилювання (Руководство по изучению биологического окислення полярографическим методом / Под ред Г М Франка - М Наука, 1973 - 2 2 2 с) Використання мишей лінії СВА зарекомендувало себе із позитивної сторони у експериментах з моделювання сальпінгіту за допомогою людських штамів Chlamydia trachomatis, оскільки запальні зміни статевих органів самок саме цієї лінії мишей спостерігались протягом більш тривалого періоду, що свідчить про генетичну схильність даної лінії до людських штамів хламідій (Salpmgitis in mice induced by humen strains of Chlamydia trachomatis / MTuffrey, P Falder, J Gale, D Taylor-Robinson // Br J exp Path -1986 -67 -P 605-616) Спосіб здійснюють таким чином Мишам лінії СВА вагою 10-12 г внутрішньочеревно уводять 10% завіси жовткових МІШКІВ інфікованих хламідіями курячих ембріонів, які готують на фізрозчині (по 0,1 мл на тварину) Мишей декапітують за 25-30 діб, щоб збудник встиг пройти усередині організму хазяїна кілька циклів розвитку Наявність морфологічних структур збудника у внутрішніх органах хазяїна підтверджують фарбуванням мазків-відбитків печінки, легенів, селезінки за методом ПІФ і за Маккіавелло (Шаткин А А , Мавров И И Урогенитальные хламидиозы - Киев Здоров'я, 1983 - 200 с) Печінки мишей взважують у охолодженому розчині такого складу сахароза -100 мМ, КСІ -100 мМ, тріс-НСІ -10 мМ, ЕГТА - 1 мМ, КН2РО4 - 2 мМ, рН 7,4 Посушені на фільтровальній бумазі печінки роздрібнюють ножицями на годинниковому склі та суспендують у скляному гомогенізаторі Портера у розчині вищезгаданого складу у співвідношенні 1 1 Здобутий гомогенат фільтрують через три шари марлі Усі операції проводять на холоді Швидкості споживання кисню гомогенатами печінки вимірюють у середовищі, склад котрого наданий вище Як субстрат окислення додають малат (1 мМ) з глутаматом (5 мМ) або сукцінат (10 мМ) Субстратами фосфорилювання служать АДФ (200 мкМ) та КН2РО4 (2 мМ) Швидкість споживання кисню перераховують на мг білку, який міститься у аліквоті печінкового гомогенату Білок визначають за методом Лоурі Швидкість дихання гомогенатів визначають за зменшенням концентрації кисню у герметично зачиненій чарунці, коли приплив кисню ззовні виключений або зневажливо малий У свою чергу, концентрацію кисню у чарунці реєструють полярографічно за допомогою закритого електроду типа Кларка Як індикаторний електрод (катод) використовують платину високого ступеню очищення з полірованою поверхнею, як електрод зрівняння (анод) - срібло, укрите АдСІ (покриття електрохімічне у 0,1 М НСІ при ЩІЛЬНОСТІ 2 струму 10 мкА/см ) Вимірювання проводять на універсальному полярографі перемінного струму ППС-1, який серійно вироблявся у СРСР Сигнал реєструють на самописному потенціометрі КСП-4 Полярографічну чарунку розміщують на магнітну мішалку До розміщення у чарунці середовище шкубують при 26°С в ультратермостаті Плато діфузійного струму спостерігають у діапазоні -0,460,8 В Роботу слід проводити, надаючи на електрод напругу - 0,65 В Оптимальний об'єм гомогенату, що вноситься до чарунки, підбирають так, щоб КІЛЬКІСТЬ білку у чарунці складала 2-3 мг/мл Статистичну обробку результатів проводять за методом Ст'юдента-Фішера Спосіб ілюструє наступний приклад внутрішньочеревне введення лімфогранулемного штаму Bu-434 Chlamydia trachomatis при навантаженні ADP збільшує інтенсивність фосфорилювання (ІФ) на 12% у гомогенатах печінки при використанні сукцінату як субстрата дихання, що свідчить про регуляторний вплив хламідій на дихальний ланцюг (ІФ контроля=37,22±1,9 (п=11), ІФ досліду=41,67± ±2,33 (п=14)) Застосування запропонованого способу визначення енергетичного обміну при експериментальному хпамідюзі з використанням FADH2- і NADH-залежних субстратів дихання у комбінації з різними активаторами і інгібіторами окислювального фосфорилювання дозволить виявити точку прикладення регуляторного впливу хламідій на ланки дихального ланцюгу ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Киів-133, бульв Лесі Українки, 26 (044)295-81-42, 295-61-97 Підписано до друку Обсяг обл -вид арк 2002 р Формат 60x84 1/8 Тираж 50 прим Зам УкрІНТЕІ, 03680, Киів-39 МСП, вул Горького, 180 (044) 268-25-22