Спосіб визначення енергетичного метаболізму міокарда

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в биологической химии, физиологии и патологической физиологии. Постановка проблемы. На современном этапе развития биохимии и физиологии возникла необходимость проведения комплексных исследований, предусматривающих возможность сопоставления разнообразных параметров изучаемых биологических объектов, в частности биохимических критериев энергетического метаболизма в ткани миокарда. В связи с этим к настоящему времени разработаны и продолжают активно разрабатываться многочисленные методы определения ферментативной активности и содержания метаболитов различных циклов энергетического обмена, однако большинство из используемых методик рассчитаны на определение какого-либо одного или, в лучшем случае, двух параметров определенного метаболического цикла. В свою очередь, это исключает проведение сопоставительного биохимического анализа одного образца (объема ткани) и часто приводит к неоправданным усреднениям и ошибочным заключениям о характере корреляций между разными циклами энергетического метаболизма миокарда. Кроме того, разработанные методики предусматривают использование относительно большого количества биологического материала (1-5 г), что не позволяет проводить биохимический анализ энергообмена в эмбриональном сердце мелких лабораторных животных (мышей, крыс, хомяков, морских свинок и др.) и в биопсийном материале при проведении диагностических операций в клинике. Указанные причины явились стимулом для разработки комплексной методики параллельного количественного определения ферментативной активности и ведущих метаболитов, характеризующих разные энергетические циклы в одном образце при использовании сравнительно небольшого количества ткани миокарда. Характеристика аналога 1. В биохимических и физиологических исследованиях известен "Способ исследования метаболизма миокарда" [1], основанный на инфузии сердца животного субстратом и последующем изменении его концентрации в артериальной и венозной крови. К недостаткам этого способа следует отнести его трудоемкость и продолжительность проведения, а также ограниченную информативность, связанную с тем, что в ходе одного эксперимента исследуется лишь один из многочисленных биохимических показателей метаболизма миокарда. Характеристика аналога 2. Известен также "Способ определения содержания креатинина, креатина и саркозина в биологических жидкостях" [2], заключающийся в инкубации пробы с реагентом, содержащим буферные вещества и другие ингредиенты, с последующим измерением интенсивности окраски полученной смеси со стандартным образцом при длине волны 546 нм. Основными недостатками способа являются невозможность использования биологических тканей и органов, а также значительный расход биологических жидкостей (3-5 мл). Характеристика прототипа. Наиболее близкой по решаемой задаче является методика определения активности дегидрогеназа пентозофосфатного пути [3]. Указанная методика основана на фракционировании гомогенате исследуемого образца (кусочка ткани массой 1-5 г) методом дифференциальнго центрифугирования в солевом буфере, состоящем из 0,15 Μ КСІ и 0,02 Μ КНСО3(рН 7,5) и получении цитоплаз-матической и митохондриальной фракций. Определение ферментативной активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.49) и 6фосфоглюконатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.44) в полученных фракциях проводят в инкубационной среде (объем 3,0 мл), содержащей 5 мкМ трис-НСl буфер, 50 мкМ MgCI2, 5 мкМ субстрата (клюкоэо-6-фосфат (натриевая соль) или 6-фосфоглюконат (натриевая соль)). В кювету спектрофотометра наливают 3 мл инкубационной среды, 0,1 мл гомогената и начинают реакцию добавлением 0,1 мл 5 мкм раствора НАДФ. Изменение оптической плотности раствора в ходе де-гидрогеназной реакции регистрируют спектрофотометрически в течение 5 мин с интервалом 1 мин. Расчет активности ферментов проводят по формуле: где а - содержание белка в исследуемой пробе, мг; ΔΕ - изменение оптической плотности раствора в среднем за 1 мин. Содержание белка в пробе определяют по методу Bradford [4]. Для этого 0,1 мл митохондриальной или плазматической фракций образца вносят в 5 мл 0,01% раствора Кумассии G-250, содержащего 4,7% этанола и 8,5% ортофосфорной кислоты. Через 2 мин измеряют оптическую плотность раствора с помощью спектрофотометра при длине волны 595 нм. Содержание белка определяют по калибровочной кривой, полученной при использовании известных концентраций альбумина. К недостаткам указанной методики относятся: 1) значительный расход биологического материала, что не позволяет проводить определение ферментативной активности в объеме ткани массой менее 1 г; 2) ограниченная информативность исследования, связанная с невозможностью параллельного определения и сопоставления активности нескольких ферментов из различных циклов энергетического метаболизма; 3) ограниченная точность методов, связанная с невозможностью одновременного определения активности фермента и соответствующего субстрата в одном образце (участке ткани). Характеристика решаемой задачи и технические результаты, которые могут быть получены. В основу предлагаемого изобретения поставлена задача усовершенствования способа определения энергетического метаболизма миокарда, основанного на спектро-фотометрической регистрации образования восстановленной формы никотинамидди-нуклеотида в инкубационной среде, в котором за счет параллельного определения активности цитоплазматической и митохондриальной фракций различных ферментов энергетического метаболизма обеспечивается возможность проведения количественного сопоставления интенсивности разных метаболических циклов в одном образце ткани миокарда, в том числе на ограниченном количестве ткани (биопсийный материал при диагностических операциях в клинике; мелкие лабораторные животные, эмбриональное сердце), повышается точность исследования. Совокупность существенных признаков. Для решения поставленной задачи в способе определения энергетического метаболизма миокарда, основанном на спектро-фотометрической регистрации образования восстановленной формы никотинамиддинуклеотида в инкубационной среде, согласно изобретению после гомогенизации 150 мг ткани миокарда проводят параллельное определение активности цитоплазматиче-ской и митохондриальной фракций лактатдегидрогеназы (КФ 1.1.1,27), пируватдегид-рогеназы (КФ 1.2.4.1), НАД-зависимой ма-латдегидрогеназы (КФ 1.1.1.37), аланинами-нотрансферазы (КФ 2.6.1.2), аспартата-минотрансферазы (КФ 2.6.1.1), глюкозо-6фосфатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.49), 6-фос-фоглюконатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.44), сукцинатдегидрогеназы (КФ 1.3.99.1), концентрации общего белка циоплазмы и митохондрий, лактата, пирувата и малата. Причинно-следственная связь между совокупностью существенных признаков и техническим результатом. За счет того, что в гомогенате одного образца проводят параллельное определение активности ферментов и метаболитов различных циклов энергетического метаболизма в цитоплазматической и митохондриальной субклеточных фракциях (цикл трикарбоновых кислот, окислительное фосфорилирование, трансаминирование, пентозо-фосфатный шунт и др,), получена возможность количественного сопоставления интенсивности разных метаболических циклов в одном образце ткани миокарда или определенном его участке, в том числе при наличии ограниченного количества ткани (150 мг), что имеет определяющее значение при работе с биопсийным материалом в кардиологической практике, при проведении экспериментов на мелких лабораторных животных (мыши, крысы, хомяки, морские свинки и др.) и с эмбриональным сердцем. Параллельное определение активности фермента и содержания соответствующего ему метаболита (сукцинатдегидрогеназа - сук-цинат; лактатдегидрогеназа - лактат) существенно повышает точность исследования, позволяет снизить расход материалов. Пример конкретного выполнения способа. Из 150 мг ткани миокарда белой беспородной крысы получен 5%-ный тканевый гомогенат. Из 3 мл приготовленного на холоде гомогената отобрано 1,6 мл для определения концентрации лактата, малата,' пирувата, а оставшуюся часть (1,4 мл) подвергли дифференциальному центрифугированию для определения ферментативной активности цитоплазматической и митохондриальной фракций лактатдегидрогеназы (ЛДГ; КФ 1.1.1.27), пируватдегидрогеназы (ПДГ; КФ 1.2.4.1), НАД-зависимой малатдегидрогена-зы (НАД-МДГ; КФ 1.1.1.37), аланинаминот-рансферазы (АлАТ; КФ 2.6.1.2), аспартатаминотрансферазы (АсАТ; КФ 2.6.1.1), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (ГбфДГ; КФ 1.1.1.49), 6-фосфоглюконатде-гидрогеназы (6фДГ; КФ 1.1.1.44), сукцинатдегидрогеназы (СДГ; КФ 1.3.99.1) и концентрации общего белка цитоплазмы и митохондрий по методу Bradford [4]. Для определения концентрации субстратов (лактата, малата, пирувата, малонового диальдегида) провели их кислотную экстракцию из гомогената. Отобрали по 0,2· мл экстракта и внесли в 2,8 мл инкубационной среды при 37°С, состав которой: для лактата: 0,4 Μ гидразин, 1 Μ глицин, 10 мМ ЭДТА, 3 мМ НАД, 50 мкг белка ЛДГ (рН 7.5); для малата: 0,4 Μ гидразин, 1 Μ глицин, 10 мМ ЭДТА, 2 мМ НАД, 150 мкг белка МДГ (рН9,5); для пирувата: 0,5 Μ триэтаноламин, 5 мМ ЭДТА, 6 мМ НАДН, 50 мкг белка ЛДГ(рН 7,6). Спектрофотометрически измерили исходную оптическую плотность пробы и спустя 5 мин после добавления экстракта при длине волны 340 нм. Содержание субстратов (в мкмоль на 1 г ткани миокарда) определяли по формулам: концентрация лактата: X = 18.46ΔΕ; концентрация пирувата: X = 2,33 ΔΕ; концентрация малата: X = 2,08 ΔΕ; где ΔΕ - изменение оптической плотности пробы в ходе ферментативной реакции восстановления лактата; где ΔΕ - изменение оптической плотности пробы в ходе ферментативной реакции восстановления пирувата; где ΔΕ - изменение оптической плотности пробы в ходе ферментативной реакции восстановления малата. Содержание субстратов составило: концентрация лактата: 2,04 мкмоль/г; концентрация пирувата: 0,14 мкмоль/г; концентрация малата: 0,36 мкмоль/г. Для определения количества белка в пробе по методу Bradford [4] 0,1 мл образца (митохондриальной или цитоллазматиче-ской фракции) внесли в 5 мл 0,01 % раствор Кумасси G-250, содержащий 4,7% этанола и 8,5% ортофосфорной кислоты. Через 2 мин измерили оптическую плотность растврра с помощью спектофотометра при длине волны 595 нм. Содержание белка определили по калибровочной кривой, полученной при использовании известных концентраций альбумина, Содержание белка составило: в митохондриальной фракции: 53,6 мг/г; в цитоплазматической фракции: 18,3 мг/г. Для определения активности ферментов энергетического метаболизма (ЛДГ, ПДГ, НАД-МДГ, АлАТ, АсАТ, Г6фДГ, 6фГДГ, СДГ) приготовили разведения цитоплазматической и митохондриальной фракций следующим образом: для ЛДГ, НАД-МДГ, ПДГ: к 0,1 мл фракции (цитоплазматической или митохондриальной) добавили 2,4 мл среды выделения; для АлАТ, АсАТ, СДГ: к 0,4 мл фракции добавили 1,6 мл среды выделения; для Г6фДГ, 6фГДГ: неразведенные фракции. Приготовили инкубационные среды следующего состава: для ЛДГ: 50 мМ К-фосфатный буфер (рН 7,5), 0,3 мМ пируват, 0,15 мМ НАД; для ПДГ: 140 мкМ трис- HCI (рН 8,0), 5 мкМ пируват, 20 мкМ МдСІг, 2 мкМ тиа-минпирофосфат, 2 мкМ НАД, 5 мкМ меркап-тоэтанод, 1 мкМ ЭДТА; для НАД-МДГ: 85 мМ Na-глициновый буфер (рН 10,0), 85 мМ D.L-малат натрия, 25 мМ НАД; для АсАТ: 0,1 Μ фосфатный буфер (рН 7,4), 0,2 Μ D.L-аспартат, 2 мМ альфа-кетоглу-тарат, 0,02% 2,4динитрофенилгидразин; для АлАТ: 0,1 Μ фосфатный буфер (рН 7,4), 0,2 Μ D.L-аланин, 2мМ альфа-кетоглута-рат, 0,2% 2,4динитрофенилгидразин; для Г6фДГ: 5 мкМ трис-HCI буфер, 50 мкМ MgCI2,5 мкМ глюкозо-6-фосфат (натриевая соль); 2,5 мкМ НАДФ; для 6фГДГ: 5 мкМ трие-HCf буфер, 50 мкМ MgCI2, 5 мкМ 6-фосфоглюконат (натриевая соль); 2,5 мкМ НАДФ; для СДГ: 80 мМ фосфатный буфер (рН 7,4), 10 мМ сукцинат, 2,5 мМ феррицианид калия, 15 мМ азид натрия, 2,5 мМ ЭДТА. Для определения активности ЛДГ 0,2 мл образца (разведенной цитоплазматической или митохондриальной фракции) внесли в 2,8 мл инкубационной среды при 37°С. Измерили оптическую плотность раствора с интервалом 30 сек в течение 3 мин с помощью спектрофотометра при длине волны 340 нм. Активность ЛДГ (мкмоль НАД/мин на 1 мг белка) вычисляли по формуле: где ΔΕ - среднее значение изменений оптической плотности пробы за 1 мин; а - количество белка в пробе (мг). Активность ЛДГ составила: в митохондриальной фракции: 0,39 мкмоль НАД/мин на 1 мг белка; в цитоплазматической фракции: 1,68 мкмоль НАД/мин на 1 мг белка. Для определения активности ПДГО,2 мл образца внесли в 2,8 мл инкубационной среды при 37°С. Измерили оптическую плотность раствора с интервалом 15 сек β течение 2 мин с помощью спектрофотометра при длине волны 340 нм. Активность ПДГ (мкмоль НАДН/мин на 1 мг белка) вычисляли по формуле: где ΔΕ - среднее значение изменений оптической плотности пробы за 1 мин; а - количество белка в пробе (мг). Активность ПДГ составила: в митохондриальной фракции: 23,8 мкмоль НАД/мин на 1 мг белка; в цитоплазматической фракции: 12,3 мкмоль НАД/мин на 1 мг белка. Для определения активности НАД-МДГ 0,2 мл образца внесли в 2,8 мл инкубационной среды при 37°С. Измерили оптическую плотность раствора с интервалом 30 сек в течение 3 мин с помощью спектрофотометра при длине волны 340 нм. Активность НАДМДГ (мкмоль НАДН/мин на 1 мг белка) вычислили по формуле: где ΔΕ - среднее значение изменений оптической плотности пробы за 1 мин; а - количество белка в пробе (мг). Активность НАД-МДГ составила: в митохондриальной фракции: 1,24 мкмоль НАД/мин на 1 мг белка; в цитоплазматической фракции: 2,11 мкмоль НАД/мин на 1 мг белка. Для определения активности АлАТ и АсАТ 0,1 мл образца внесли в 1 мл соответствующей инкубационной среды и инкубировали в течение Τ часа при 37°С. Затем к смеси прибавили 0,5 мл 0,4 Μ NaOH и через 30 мин измерили оптическую плотность раствора с помощью спектрофотометра при длине волны 505 нм. Активность аминотрансфераза (мкмоль пирувата/час на 1 г белка) вычислили по калибровочной кривой, которую строили таким образом, чтобы в пробах находилось от 0,05 до 0,30 мкМ пирувата. Активность трансаминаз составила: АлАТ - 0,346 мкмоль пирувата/г ткани в час; АсАТ - 0,633 мкмоль пирувата/г ткани в час. Для определения активности ГбфДГ и бфГДГ 0,1 мл образца внесли в 2,9 мл инкубационной среды при 37°С. Измерили оптическую плотность раствора с интервалом 1 мин в течение 5 мин с помощью спектрофотометра при длине волны 340 нм. Активность ГбфДГ и бфГДГ (нмоль Η АД Η /мин на 1 мг белка) вычислили по формуле: где ΔΕ - среднее значение изменений оптической плотности пробы за 1 мин; а - количество белка в пробе (мг). Активность ГбфДГ составила: в митохондриальной фракции: 6,14 нмоль НАД/мин на 1 мг белка; в цитоплазматической фракции: 2,43 нмоль НАД/мин на 1 мг белка. Активность бфГДГ составила: в митохондриальной фракции: 3,87 нмоль НАД/мин на 1 мг белка; в цитоплазматической фракции: 1,22 нмоль НАД/мин на 1 мг белка. Для определения активности СДГ 0,5 мл образца внесли в 1,0 мл инкубационной среды и инкубировали в течение 15 мин при 37°С. После инкубации к пробе внесли 1,5 мл 20%-ной трихлоруксусной кислоты. В контрольные пробы трихлоруксусную кислоту добавили перед внесением образца. После осаждения денатурированного белка над-осадочную жидкость спектрофотометриро-вали при длине волны 420 нм. Активность СДГ (нмоль сукцината/мин на 1 мг белка) вычислили по калибровочной кривой, которую строили таким образом, чтобы в пробах находилось от 100 до 1000 мкг феррициани-да калия, при использовании формулы: где m - количество восстановленного ферри-цианида в пробе (мкг); а - содержание белка в пробе (мг); Μ - молекулярная масса феррицианида калия; t - время инкубации (мин). Активность СДГ в ткани миокарда составила 12,4· нмоль сукцината/мин на 1 мг белка. Предлагаемым способом проведены исследования на 158 образцах ткани миокарда белых крыс, мышей, морских свинок, их эмбрионов, а также на 12 случаях биопсий, полученных при проведении диагностических операций в кардиологических клиниках. В 84% случаев было достигнуто повышение точности определения ферментативных активностей, выявленное на основании биометрического анализа. Таким образом, как видно из примера конкретного выполнения, предлагаемый способ позволяет проводить определение энергетического метаболизма миокарда у мелких лабораторных животных, в эмбриональном сердце и в биопсийном материале (за счет снижения массы образца до 150 мг). Кроме того, впервые получена возможность количественного сопоставления интенсивности разных метаболических циклов в одном образце ткани миокарда или в определенном его участке (за счет параллельного определения активности ферментов цикла трикарбоновых кислот, окислительного фосфорилирования, трансаминирования, пентозофосфатного шунта), повышена точность исследования (за счет параллельного определения активности фермента и соответствующего ему метаболита).