Спосіб культивування ембріональної нервової тканини

Спосіб культивування ембріональної нервової тканини шляхом інкубації у стандартному живильному середовищі при 37°С, який відрізняється тим, що додатково використовують живильне середовище, яке являє собою агаровий гель, що містить гомогенат м'яких оболонок мозку ембріонів людини Винахід належить до експериментальної біологи, зокрема морфологи, патоморфологп фізіологи та патофізіології, і може бути використаний для оцінки морфологічної та функціональної ПОВНОЦІННОСТІ тканин ЦНС з метою їх подальшої трансплантації Відомо кілька методів культивування ембріональної нервової тканини (ЕНТ) органотипічне, культивування в умовах шарової культури та культивування реагрегатів [1] Найбільш близьким до способу, що заявляється є спосіб органотипічного культивування експлантатів закладини кори великих півкуль головного мозку ембріонів людини на колагеновому субстраті [2] У цьому випадку на знежирені покроєні скельця, розташовані у стерильних чашках Нетрі, наносять одну-дві краплі діалізованого колагену та равномірно розподіляють по поверхні скла На кожне скло у культуральній посудині поміщають експлантати та наносять 1 - 2 краплі стандартного живильного середовища, яке містить 15% ембріональної телячої сироватки, 60% повного середовища ДМЕМ, 20% сольового розчину Хенкса з додаванням інсуліну, глюкози та антибіотиків та Lглютамшу Зміну середовища здійснюють ДВІЧІ на тиждень фактори росту) В основу винаходу поставлена задача створити такий спосіб культивування ЕНТ, у якому би використання модифікованого живильного середовища, яке має бюстимулюючую дію, дозволило подовшити строк культивування Ця задача вирішується тим, що у способі культивування ЕНТ шляхом інкубації у стандартному живильному середовищі при 37°С додатково використовують живильне середовище, яке являє собою агаровий гель, що містить гомогенат м'яких оболонок мозку ембріонів людини Агаровий гель має трьохмірну структуру та оточує культивуєму тканину, що дозволяє експлантатам уникнути ризику видалення під час зміни середовища Гомогенат м'яких оболонок ембріонального мозку містить низку сполук, які мають нейритетимулюючі та мітогенні властивості [3], тому використання живильного середовища, яке містить гомогенат м'яких оболонок мозку ембріонів людини дозволяє подовшити строк культивування у порівнянні з прототипом майже на 2 тиждня, тобто до 35 діб, що створює умови реалізації бластними формами клітин своїх морфогенетичних потенцій з виявленням явищ мієлінізацп на 21 добу Спосіб пояснюється таким прикладом В асептичних умовах готували гомогенат м'яких оболонок мозку ембріонів людини 12 тижнів гестацп, одержаних при штучному аборті Для цього відокремлені оболонки мозку переносили до скляного гомогенізатора Потера з 0,5 - 1,0мл розчину Хенксу та товкачом обережно роздавлювали фрагменти до одержання однорідної маси Одер Основним недоліком цього способу є обмежений строк культивування (21 доба), внаслідок чого клітини ЕНТ не реалізують свої морфогенетичні потенції у повному обсязі Це можна пояснити відсутністю у стандартному живильному середовищі специфічних ростових факторов (фактор росту фібробластів, нейротрофічний та епідермальний 00 ю 58192 жану суспензію пропускали крізь пристрій для переливання крові та кровозамінників (ПК-11-03), а потім крізь ІН'ЄКЦІЙНІ ГОЛКИ діаметру, що зменшу ється Далі розпочинали приготування модифікованого живильного середовища Для цього 8 часток попередньо підігрітого до 40°С стандартного живильного середовища змішували з 1 часткою гарячого 5,5%-ного бактоагару ("Difco"), витримували на водяной бані при 40°С та додавали 1 частку гомогената м'яких оболонок мозку ембріонів людини 12 тижнів гестаци Кінцева концентрація клітин у модифікованому живильному середовищі складала 1 - 1,5*106клітин/мл, а агару 0,55% Суміш агарового середовища з клітинами розливали по 1,5мл у одноразові пластикові чашки Петрі та залишали при кімнатній температурі для застигання Чашки Петрі з модифікованим живильним середовищем розташовували у стандартних умовах культивування (37°С, 7,5% ССЬ 100% вологість) та витримували 7 діб для "достигання" клітин Безпосередньо в день експерименту в стерильних умовах мозок ембріонів людини потрібного строку гестацм розрізали на кілька фрагментів розміром 1 - Змм Експлантати розташовували на застиглий шар модифікованого живильного середовища та покривали 1мл стандартного живильного середовища, що містило 15% ембріональної телячої сироватки, 60% повного середовища ДМЕМ, 20% сольового розчину Хенкса з додаванням інсуліну, глюкози, антибіотиків та L-глютамшу Кінцева концентрація агару у верхньому шарі складала 3,3% Культивування проводили в стандартних умовах Перегляд та приготування постійних препаратів проводили на 7, 14, 21, ЗО та 35 добу культивування 3 метою обліку змін клітин у культурі використовували прижиттєву світлову й фазовоконтрасну мікроскопію та аналіз пофарбованих препаратів Фарбування агарових дисків проводили азур-еозіном за Романовським, суправітально Комп'ютерна верстка М Клюкш метиленовим синім, крезиловим фіолетовим за Нісслем та судаковим чорним Розвиток експлантатів при культивуванні ЕНТ у двошаровій агаровій культурі проходило ВІДПОВІДНО ІЗ закономірностями, встановленими для тканинних культур Загальний строк культивування складав 35 діб з вираженими явищами мієлінізацм на 21 добу Відзначено особливий тип росту нейротканини у крайових зонах експлантату, який спостерігався на другому тижні культивування як "ланцюжки"' мігруючих елементів Численні "ланцюжки" клітин є способом міграції нервових клітин, що не залежить від радіальної глм Згідно з даними літератури, подібним шляхом нейрональні попередники мігрують з ростральної субвентрикулярної зони в зону нюхової луковиці [4] Вважають, що ці клітини використовують партнерів як міграційний субстрат Таким чином, агарова культура з живильним шаром, який містить гомогенат м'яких оболонок мозку ембріонів людини, є адекватною довгостроковою моделлю для дослідження поведінки клітин мозку людини у культурі Джерела інформації 1 Руководство по культивированию нервной ткани Методы Техника Проблемы - М Наука, 1988 -с 318 2 Бобрышев Ю В , Балабанов Ю В , Павлов О В и др Электронно-микроскопическое исследование развития нейронов в органотипических культурах закладки коры головного мозга эмбриона человека Цитология, 1989, №12, С 1453 1457 3 Цимбалюк В I , Васильева I Г, Олексенко Н П та ІНШІ Вплив екстракту фетальної нервової тканини на вміст гаммаамшомасляної кислоти у культурі нервових клітин Трансп л антологія, 2001, том 2, №1, С 70-73 4 Doetsch F , Alvarez-Buylla A Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain Proc Natl Acad Sci USA, 1996, Vol 93, №25, 14895-4900 Підписано до друку 05 08 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна