Спосіб кількісного визначення вмісту антигену в біологічних тканинах

Спосіб кількісного визначення вмісту антигену в біологічних тканинах, що включає обробку біологічного зразка розчином моноклонального антитіла, позначеного молекулами флюорохрому, та реєстрацію величини яскравості флюоресценції антигенвмісної структури, який відрізняється тим, що додатково реєструють величину яскравості флюоресценції фону, а кількісний вміст антигену визначають за формулою: Д H log оп , Дф Корисна модель відноситься до медицини, а саме до лабораторних способів дослідження зразків біологічних тканин і клітин, які можуть бути використані для встановлення діагнозу. Методи кількісної морфології в анатомоклінічних дослідженнях захворювань імунної, ендокринної, ретикуло-ендотеліальної і нервової систем доводять існування визначеної кореляції між якісними і кількісними властивостями структур біологічних тканин і патологічною картиною органів і систем. Якісні і кількісні виміри в біологічних тканинах і клітинах структур, які мають властивості антигену, є важливою задачею морфології. Для виявлення в тканинах і клітинах структур, що мають властивості антигену, широко використовується метод імуногістофлюоресценції (ІГФреакція) (Ташке К. Введение в количественную цито-гистологическую морфологию. - Румыния: Изд-во Академия, 1980. - 191с.). Спеціалізовані лабораторії виготовляють моноклональні антитіла (МКА) і антисироватки до різноманітних антигенів - білкових гормонів, колагенів, ферментів, антигенів лейкоцитів. Міткою антитіла є молекула флюорохрому - флюоресцеінізотіоціанат (ФІТЦ). При обробці зрізу розчином МКА, міченого ФІТЦ, відбувається фіксація антитіла переважно на специфічних антигенах, тобто йде реакція антиген + антитіло. Перегляд препарату в люмінесцентному мікроскопі дозволяє побачити світіння ФІТЦ у ділянках, де знаходиться комплекс антиген + антитіло. При відсутності МКА, мічених ФІТЦ, ІГФреакцію здійснюють методом "подвійного сендвіча". При цьому специфічні МКА одержують імунізацією визначеної тварини (морська свинка, кролик, щур). Потім проводять 2-й етап ІГФ-реакції: мікропрепарати обробляють антисироваткою іншої тварини, міченої ФІТЦ, до імуноглобуліну G, тобто і до специфічних МКА. Потім здійснюють аналіз зразка в люмінесцентному мікроскопі. Часто ставиться задача не тільки виявити структури, що несуть антиген, але й оцінити присутність антигену кількісно. Використовуючи комп'ютерне зображення мікропрепарату, програму "Photoshop-7", а також спеціальні програми для морфометрії "Видеотест" (Санкт-Петербург), "Olympus-Soft", фіксують зелене світіння обведеної ласо ділянки препарату. Чим інтенсивніше яскравість, тим більше антигену в структурі (Ташке К. Введение в количественную цито-гистологическую морфологию. - Румыния: Изд-во Академия, 1980. 191с.). Даний спосіб кількісного визначення вмісту антигену в біологічних тканинах є найбільш близьким до того, що заявляється, за технічною суттю та (19) UA (11) 46489 (13) U де: H - кількісний вміст антигену в ум. од.; Доп - величина яскравості флюоресценції в антигенвмісній структурі; Д ф - величина яскравості флюоресценції фону. 3 46489 результатом, який може бути досягнутим, тому його обрано за прототип. Основним недоліком відомого способу є відсутність обліку фонового світіння, тобто яскравості, що дають структури, які не мають даної антигенності (неспецифічне зв'язування МКА з тканинами). Крім того, не враховується різна товщина препаратів, предметних стекол і ін., що знижує точність кількісної оцінки. У зв'язку з вищевикладеним, в основу корисної моделі покладено задачу підвищення точності кількісної оцінки вмісту антигену в біологічних тканинах. Задачу, покладену в основу корисної моделі вирішують тим, що у відомому способі кількісного визначення вмісту антигену в біологічних тканинах, що включає обробку біологічного зразка розчином моноклонального антитіла, позначеного молекулами флюорохрому та реєстрацію величини яскравості флюоресценції антигенвміщуючої структури, згідно з корисною моделлю, додатково реєструють величину яскравості флюоресценції фону, а кількісний вміст антигену визначають за формулою: Д H log оп , Дф де: Н - кількісний вміст антигену в ум. од.; Доп - величина яскравості флюоресценції в антигенвміщуючій структурі; Дф - величина яскравості флюоресценції фону. Технічний ефект корисної моделі полягає в тому, що спосіб, який заявляється, дозволяє точно визначити кількість антигену в біологічних тканинах та клітинах. Спосіб виконують наступним чином: Виконують ІГФ-реакцію за методикою Brozman на парафінових зрізах. Вивчають мікропрепарати на мікроскопі "Axioscop-40" (Zeiss, ФРН). Фотографують ділянки препаратів з використанням цифрової фотокамери "Ріхега", що входить у комплект мікроскопа. На комп'ютері відкривають фото за допомогою програми Photoshop. Використовуючи ласо, обводять ділянку препарату, де необхідно провести вимір. Активізують пункт верхнього меню "Изображение". У переліку послуг, що відкрився, активізують "Гистограмма". У вікні, що відкрилося, активізують канал "Яркость" (Luminosity). Оскільки ФІТЦ має зелений колір, вибирають яскравість у зеленому діапазоні. Комп’ютерна верстка О. Рябко 4 Записують величини яскравості флюоресценції в антигенвміщуючій структурі і величини яскравості флюоресценції фону. Отримані значення підставляють у формулу. Ефективність способу ілюструє наступний приклад: Приклад. Вивчаються морфофункціональні особливості плаценти при тютюнопалінні матері і батька дитини (Кгр - група контролю, батьки не палять; МОгр - палять і матір, і батько). Задача - з'ясування рівня синтезу плацентарного гормону хоріонічного гонадотропіну (hHT) - у синцитії плацентарних ворсинок. Використано антисироватку до hHT, мічену ФІТЦ. Поставлено ІГФ-реакцію за методикою Brozman на парафінових зрізах. Аналіз мікропрепаратів (синцитії плацентарних ворсинок Кгр і МОгр) здійснюють на мікроскопі "Axioscop-40" (Zeiss, ФРН). Фотографують ділянки препаратів з використанням цифрової фотокамери "Ріхега", що входить у комплект мікроскопа. Відзначають, що ділянки специфічного світіння в контрольній групі (Кгр) зустрічаються частіше, але світіння виглядає менш інтенсивним, чим у МО гр. На комп'ютері відкривають фото за допомогою програми Photoshop. Використовуючи ласо, обводять ділянку препарату, де необхідно провести вимір. Активізують пункт верхнього меню "Изображение". У переліку послуг, що відкрився, активізують "Гистограмма". У вікні, що відкрилося, активізують канал "Яркость" (Luminosity). Оскільки ФІТЦ має зелений колір, вибирають яскравість у зеленому діапазоні. Записують величини яскравості флюоресценції в антигенвміщуючих структурах (Доп) і фону (Дф) у синцитії плацентарних ворсинок для групи контролю (Кгр) і основної групи (МОгр): Доп Кгр: 130, 139, 137, 120, 135, 146, 134, 129, 140, 136, 121, 135, 147, 133 М±m 134,4±2,1; Доп МОгр: 140, 122, 122, 111, 112, 142, 124, 120, 120, 110, 113, 114, 141, 139 М±m 123,6±3,5. Дф Кгр: 46, 49, 42, 46, 53, 53, 51, 45, 50, 40, 48, 54, 52, 50 М±m 48,5±1,2. Дф МОгр: 29, 30, 29, 24, 27, 28, 30, 27, 32, 30, 23, 25, 30, 31 М±m 28,2±0,8. Визначають кількісне значення антигену: 134 ,4 у Кгр HK log ум.од. 48 ,5 123 ,6 у МОгр HMO log ум.од. 28 ,2 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601