Спосіб отримання клітин нервової тканини із мезенхімальних клітин тканини ссавців

Спосіб одержання клітин нервової тканини із мезенхімальних клітин тканини ссавців шляхом культивування в специфічних середовищах з додаванням у середовище індукторів нервової тканини, який відрізняється тим, що для отримання мезенхімальних клітин застосовують жирову тканину. (19) (21) u200909538 (22) 17.09.2009 (24) 25.03.2010 (46) 25.03.2010, Бюл.№ 6, 2010 р. (72) МИКУЛИНСЬКИЙ ЮРІЙ ЮХИМОВИЧ, ХВИСЮК ОЛЕКСАНДР МИКОЛАЙОВИЧ, ЗАБІРНИК АРСЕНІЙ СЕРГІЙОВИЧ, ПАНІБРАТЦЕВА СВІТЛАНА ГЕОРГІЇВНА, КУЛЬШИН ВОЛОДИМИР ЄВГЕНОВИЧ, ОМЕЛЬЧЕНКО ОЛЕНА АНАТОЛІЇВНА, АНТОНЯН ІГОР МИХАЙЛОВИЧ 3 В основу корисної моделі поставлена задача удосконалення способу отримання клітин нервової тканини із мезенхімальних клітин тканини ссавців, в якому за рахунок зміни джерела постачання стовбурових клітин, та за рахунок застосування специфічних нейроіндукторів в комплексі з допоміжними факторами та підібраними умовами культивування, досягається диференціювання отриманих клітин в нервові. Поставлена задача вирішується в способі отримання клітин нервової тканини із мезенхімальних клітин тканини ссавців шляхом культивування в специфічних середовищах з додаванням у середовище індукторів нервової тканини, який відрізняється тим, що для отримання мезенхімальних клітин застосовують жирову тканину. За рахунок того, що до культури мезенхімальних клітин жирової тканини додається специфічний нейроіндуктор, створюються оптимальні умови для переходу клітин в диференційований стан та сприятливі умови для культивування клітин нервової тканини, досягається спрямована індукція мезенхімальних клітин жирової тканини (МКЖТ) в клітини нервової тканини. Особливий інтерес в останній час викликають клітини, отримані із жирової тканини - МКЖТ. Отримання зразків жирової тканини можливо, наприклад при косметичних операціях, спрямованих на вилучення зайвих жирових відкладень. Жирова тканина вважається найбільш перспективним джерелом стовбурових клітин завдяки достатньо високому вмісту цих клітин, безпеки та низької травматичності їх отримання. Сутність способу полягає у підборі специфічних умов диференціювання і культивування мезенхімальних клітин жирової тканини, результатом яких є отримання в різному ступені диференційованих нервових та гліальних клітин. Це пояснюють малюнки Фіг.1-3, де зображена направлена індукція МКЖТ в клітини нервової тканини. Фіг.1. Інтактна первинна культура мезенхімальних клітин жирової тканини щура. Зб. 200х 6 доба культивування Фіг.2 - Інтактна первинна культура мезенхімальних клітин жирової тканини щура. Зб. 200х 11 доба культивування Фіг.3. Індукція мезенхімальних клітин жирової тканини в нервові і гліальні клітини під дією ретиноєвої кислоти. (біполярні нейрони). Фіг.4 - Індукція мезенхімальних клітин жирової тканини в нервові і гліальні клітини під дією ретиноєвої кислоти, гліальна клітина поряд з недиференційованими клітинами Фіг.5. Диференціювання мезенхімальних клітин жирової тканини в клітини нервової тканини під дією ретиноєвої кислоти. Іммуноцитохімічний аналіз. Зб. 200х, -тубулін-позитивний мультиполярный нейрон поряд з недиференційованою фібробластоподібною клітиною строми жирової тканини. Фіг.6 - Диференціювання мезенхімальних клітин жирової тканини в клітини нервової тканини під дією ретиноєвої кислоти. Іммуноцитохімічний аналіз. Зб. 200х, клітина астроцитарної глії, позитивне забарвлення на GFAP. Спосіб, що заявляється, проілюструємо на 48553 4 прикладі диференціювання МКЖТ щура в клітини нервової тканини. Спосіб, що заявляється, здійснюють таким чином. Зразки жирової тканини щурів забирають у стерильний посуд з середовищем Хенкса. Жирову тканину фрагментують і інкубують у 0,25% розчині трипсину протягом 1 години при 37°С. Трипсин вилучають, тканину ресуспендують у середовищі DMEM/F12 (1/1) Sigma з 10% фетальної бичачої сироватки (Sigma), 2mM L-глутаміна (Sigma), 50 μg/ml гентаміцину. Клітини осаджують центрифугуванням при 1000 об/хв протягом 10 хв. Осад ресуспендують у свіжому культуральному середовищі і розсівають клітини у культуральний флакон 2 (75 см ) у 13 мл середовища. Клітини культивують при 37°С і 5% СО2 у СО2 інкубаторі протягом 12-14 днів до створення моношару. Заміну середовища проводять кожні 3-4 доби. Отримана первинна культура стромальних клітин жирової тканини, а також клітини першого пасажу застосовують для кріоконсервування у рідкому азоті. Клітинну суспензію заморожують у середовищі ДМЕМ з 10 % ДМСО і 20 % ФБС застосовуючи звичайний двухетапний спосіб (І етап -30°С, 15 хв., ІІ етап - -196°С). Культура МКЖТ подібна до культури клітин строми кісткового мозку, яку використовували в обраному прототипі. Клітини МКЖТ є фібробластоподібними клітинами, серед яких різні дослідники виділяють від 3 до 7 типів клітин з різною морфологією і проліферативною активністю. Відмінністю МКЖТ від КСКМ є наявність нетипового для КСКМ типу клітин з багатокутниковою морфологією і високим проліферативним потенціалом. Для диференціювання МКЖТ у клітини нервової тканини використовують відомий нейроіндуктор ретиноєву кислоту в комплексі з допоміжними факторами, зокрема, N-2 supplement (Sigma, cat. N. 17502-048) та змінну концентрацію ФБС. Морфологію клітин вивчають в живій культурі та після фіксації метанолом з забарвленням 1 % розчином метилового фіолетового. Клітинні культури та пофарбовані препарати вивчають за допомогою інвертованого мікроскопа «Біолам» П21(ЛОМО, Санкт-Петербург) і та цифрової фотокамери Nikon. Приклад 1. 1. Нейродиференціювання. Для направленого диференціювання МКЖТ в клітини нервової тканини використовують первинну культуру на 6-7 добу культивування або відновлену кріоконсервовану культуру першого пасажу на тих же строках культивування. На першому етапі індукції диференціювання в культурі МКЖТ базове поживне середовище замінюється на аналогічне, але без фетальної бичачої сироватки. Також в індукційне середовище додається стоковий розчин N-2 supplement 100х до фі-6 нальної концентрації 1х, та 10 М ретиноєва кислота. Індуковані клітини культивують в наведеному середовищі 1 добу, після чого індукційне середовище замінюється на аналогічне, але з 2 % ФБС. Вже на 3 добу культивування в культу 5 рі з'являється до 20 % попередників клітин нервової тканини (нейробласти, нейрони, гліальні клітини). При подальшому культивуванні в культурі нейрони можуть об'єднуватись, утворюючи структуру подібну до нервового ланцюга. Спостереження та ідентифікування клітин, що диференціюються, проводять в живій культурі та фіксованих препаратах з фарбуванням 1 % розчином метилового фіолетового або специфічними антитілами. Позитивним фактом є те, що ретиноєва кислота індукує диференціювання не тільки нейронів, а й гліальних клітин, що здійснюють підтримуючу функцію для нервових клітин. 2. Імуноцитохімічний аналіз. Культуру з нервовими клітинами, що диференціюються, промивають розчином Хенкса та фіксують метанолом при -20 °С безпосередньо в культуральному флаконі. Зафіксовані клітини промивають фосфатно-сольовим буфером(ФСБ) і послідовно інкубують у 3 % розчині перекису водню (30 хвилин) та 5 % БСА (1 година). Потім клітини інкубують з мишачими моноклональними антитілами до -тубуліну II, або з мишачими моноклональними антитілами до Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) при 4°C протягом ночі, далі з вторинними козячими анти мишачими, коньюгованими з пероксидазою хрону 1 годину при кімнатній температурі. Як барвник використовували розчин диамінобензидину (ДАБ). Нервові клітини, що забарвлюються антитілами до -тубуліну (маркеру нейронів), знаходяться в культурі поряд з недиференційованими фібробластоподібними клітинами, що не забарвлюються специфічними до нервової тканини антитілами. Серед клітин, що диференціюються переважають 48553 6 гліальні клітини, зокрема, астроцити, що специфічно забарвлюються антитілами до GFAP. При специфічному зв'язуванні антитіл з клітинамимішенями останні в результаті іммуноцитохімічної реакції забарвлюються в коричневий колір. За допомогою іммуноцитохімічної реакції з антитілами до -тубуліну та GFAP ми підтвердили, що серед клітин, що знаходяться в культурі, є клітини, які експресують вищеназвані білки. Їхня цитоплазма в результаті іммуноцитохімічної реакції зафарблюється ДАБ у коричневий колір. Число нервових клітин варіює: на початку диференціювання їх дещо більше ніж на подальших етапах, що, вочевидь, пояснюється частковим апоптозом, викликаним дією ретиноєвої кислоти. Отримані результати були відтворені нами 5 разів. При цьому були використані первинні культури та культури першого пасажу. МКЖТ були взяті від різних щурів однієї лінії. Щоразу на 2-3 добу індукції спостерігали ознаки початку диференціювання МКЖТ в клітини нервової тканини. Таким чином, мезенхімальні клітини жирової тканини являють собою нове дешеве джерело стовбурових клітин, які можна одержувати з жирової тканини пацієнта, розмножувати в культурі, заморожувати для збереження в кріобанку, диференціювати в клітини нервової тканини і використовувати для регенерації хворих і ушкоджених органів людини, зокрема, головного і спинного мозку. Використання цих клітин також дозволить вирішити оперативно-травматичні, імунологічні і етичні проблеми сучасної клітинної терапії. 7 Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко 48553 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601