Спосіб забарвлювання мієлінових оболонок нервових волокон

Спосіб забарвлювання мієлінових оболонок нервових волокон, що включає фіксацію препарату, промивання, протравлення в хромовій суміші, повторне промивання, заливку у парафін, забарвлювання в оцтовокислому гематоксиліні, чергове промивання і диференціювання, який відрізняється тим, що протравлення виконують у суміші розчину двохромовокислого калію і хромокалієвих галунів, а хромові солі відмивають спиртом. (19) (21) u201006806 (22) 02.06.2010 (24) 25.11.2010 (46) 25.11.2010, Бюл.№ 22, 2010 р. (72) КОРОБОВА ЛАРИСА КОСТЯНТИНІВНА, ЖАРОВА НАТАЛІЯ ВАЛЕНТИНІВНА (73) ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ 3 54892 весь процес забарвлювання нетривалий за часом, тобто від початкової фіксації матеріалу до одержання результату; результати дослідження не вимагають яких-небудь додаткових технік чи підтвердження іншими методиками. Даний спосіб забарвлювання мієлінових оболонок нервових волокон є найбільш близьким до того, що заявляється, за технічною суттю та результатом, який може бути досягнутим, тому його обрано за прототип. До недоліків способу-прототипу відноситься те, що для хромування досліджуваних препаратів нервової тканини використовують 2 % хромову кислоту, що у вільному виді не існує. Її виготовляють ex tempore на основі хромового ангідриду, що належить до числа найбільш сильних окислювачів, є вкрай токсичною, самозаймистою і вибухонебезпечною речовиною. Робота з хромовим ангідридом вимагає дотримання правил техніки безпеки. Для повного розчинення компонентів хромової суміші, тобто хромового ангідриду і залізоамонійних галунів, суміш підігрівають (до кипіння). У методі не зазначена конкретна температура підігріву, що при недогляді чи перегріві суміші може привести до хімічних опіків і травм. Хромовий ангідрид при зіткненні з органічними речовинами може привести до вибуху, етиловий спирт при зіткненні з ним займається. Таким чином, при роботі з хромовим ангідридом необхідно мати спеціально обладнану витяжну шафу. Швидкість процесу диференціювання препарату (5-10 хв.) сполучена з визначеними труднощами контролювання цього процесу під мікроскопом. Зокрема, при забарвлюванні не одного, а декількох препаратів одночасно, це може привести до втрати якості забарвлювання. У зв'язку з вищевикладеним, в основу корисної моделі покладено задачу підвищення безпеки способу і спрощення процедури забарвлювання. Задачу, яку покладено в основу корисної моделі, вирішують тим, що у відомому способі забарвлювання мієлінових оболонок нервових волокон, що включає фіксацію препарату, промивання, протравлення в хромовій суміші, повторне промивання, заливку у парафін, забарвлювання в оцтовокислому гематоксиліні, чергове промивання і диференціювання, згідно з корисною моделлю, протравлення виконують у суміші розчину двухромовокислого калію і хромокалієвих галунів, а хромові солі відмивають спиртом. Спосіб виконують наступним чином: 1. Препарати досліджуваної тканини товщиною до 1 см фіксують у 10-15 % формаліні 1-2 дня. 2. Відмивають у водопровідній воді 1-2 години. 3. Протравлюють 5-6 днів при кімнатній температурі в хромовій суміші (5 % розчин двухромо Комп’ютерна верстка Д. Шеверун 4 вокислого калію (К2Сr2О7) - 100 мл, хромокалієві галуни (KCr(SO4)2·12H2O) - 3 г. Компоненти розчиняють при кімнатній температурі і фільтрують. Зберігають у темній склянці. Калій двухромовокислий (біхромат калію) являє собою кристалічний порошок жовтогарячого кольору, що легко розчиняється у воді при кімнатній температурі. Хромокалієві галуни являють собою кристали синьофіолетового кольору, що легко розчиняються у воді. Їхня дія заснована на тім, що гідрооксид хрому, що утвориться внаслідок гідролізу, відкладається у волокнах тканини в дрібнодисперсному стані і, адсорбуючи барвник, міцно утримує його на волокні, утворюючи стійкі яскраво забарвлені з'єднання. 4. Препарати ретельно висушують фільтрувальним папером і відмивають надлишок хромових солей у декількох порціях 70 % спирту в темряві доти, поки спирт не перестане забарвлюватися в жовтуватий колір. Відмивання від хромових з'єднань у 70 % спирті проводять у темряві, тому що на світлі хромові солі випадають в осад. 5. Зневоднюють у 1-2 порціях 96 % спирту 24 години і перекладають у хлороформ на 1-2 години при кімнатній температурі. З хлороформу переносять у розплавлену суміш хлороформу з парафіном на 30 хв. у термостаті при 56°С. Після цього препарати перекладають у 1-й парафін, у 2-й парафін, у 3-й парафін з додаванням бджолиного воску (3-5 %) по 30 хв. при 56°С, і заливають 3-м парафіном у блоки. Роблять зрізи. 6. Забарвлюють в оцтовокислому гематоксиліні (10 % спиртовий розчин гематоксиліну - 10 мл; оцтова кислота (крижана) - 2 мл; вода дистильована - 90 мл) 24 години при кімнатній температурі. Якщо зрізи забарвилися недостатньо, то їх дофарбовують у термостаті при 56°С 1-2 години. 7. Промивають зрізи в 2-3 порціях водопровідної води 0,5-1 годину, поки вода не перестане забарвлюватися. 8. Диференціюють у суміші (2 % розчин червоної кров'яної солі - 100 мл; натрій вуглекислий - 2 г). Процес диференціювання продовжується 6-8 годин (у залежності від товщини зрізів і структури досліджуваної тканини), що дає можливість контролювати його за допомогою мікроскопа без втрати якості. 9. Промивають у водопровідній воді 15-25 хв. 10. Проводять по спиртах, карбол-ксилол, ксилол, укладають у розчин полістиролу в ксилолі і покривають покривним склом. Результат: мієлінові волокна забарвлюються в темно-синій чи синювато-чорний колір, ділянки переродження мієлінових волокон залишаються незабарвленими чи злегка жовтуватими. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601