Спосіб діагностики та ідентифікації рнк-вмісних фітовірусів

Спосіб діагностики та ідентифікації РНКвмісних фітовірусів, що включає відбір рослинного зразка (уражені ділянки листя, стебел, коренеплодів, насіння тощо), гомогенізацію в буферному розчині STE (0,1 М NaCa, 0,05 М tns-HCI, 1,0 mM EDTA, рН 7,0) в умовах рідкого азоту, фенольне виділення та очистку загальних нуклеїнових кислот та цикли целюлозного (Whatman CF-11) фракціонування, в декілька стадій з використанням 16% розчину етанолу, переведення фракції дволанцюгової РНК після целюлозного фільтрату на STE буфер без етанолу і концентрування в двох об'ємах охолодженого 95% етилового спирту та 0,1 об'єму 0,2 М натрій ацетату, рН 5,5, проведення ресуспендування в STE буфері, нанесення Винахід відноситься до сільського господарства, конкретно до вірусологи, рослинництва, селекції, насінництва та фітопатологи Відомий метод, практичність якого полягає у виділенні із загальної КІЛЬКОСТІ нуклеїнових кислот такої, що притаманна тільки вірусу - длРНК Метод вперше був запропонований і опублікований в 1979 році (Morns T J , Dodds J A Isolation and analysis of double-stranded RNA from virus infected plant and fungal tissue // Phytopathol —1979 — 6 9 — P 854 - 858) і протягом понад двадцяти років набував свого поширення у використанні Специфіка методу полягає у виявленні дволанцюгової форми вірусної нуклеїнової кислоти, яка практично відсутня у всіх представників рослинного і тваринного світу, і навіть якщо і виділяється (у рослин), то всеодно являє собою нуклеїнову кислоту вірусного походження при інфікуванні латентними вірусами із груп Реовірус або Криптовірус Тобто, виявивши і вивчивши біохімічні властивості таких длРНК, можливо чітко говорити про вірусне інфікування і, що характерно типізацію вірусного патоге отриманих проб в КІЛЬКОСТІ 40 мкл в індивідуальні кишені 6% поліакриламідного гелю (ПААГ) (1,5 мм X 7 см X 8 см, 40 1 акриламід/бісакриламід), і поміщення на вертикальний прилад для електрофорезу ("BIORAD"), який відрізняється тим, що, після першого фенольного виділення загальних нуклеїнових кислот проводять стадію першого низько швидкісного центрифугування при понижених обертах кутового ротора з 8,000 g до 6,000 д, проводять тільки одну стадію градієнта целюлози для дволанцюгових рибонуклеїнових кислот з досліджуваного зразка, отримують зразки для електрофорезу, проводять ресуспендування кінцевої фракції дволанцюгової РНК після целюлозного градієнта в 200 мкл STE буфера, проводять електрофорез при напрузі 100 V протягом 3,5 годин з КІЛЬКІСТЮ зразків в 30-40 мкл, до детального розділення вірусних дволанцюгових РНК для всіх типів вірусів в залежності від молекулярної маси та розмірів ну Описана авторами (Morns Т J , Doods ТА) методика передбачає наступні етапи м проведення необхідно зважити по 3,5г рослинного зразку (уражені ділянки листя, стебел, коренеплодів, насіння тощо) і гомогенізувати в буферному розчині STE (0,1 М NaCI, 0.05M tns-HCI, 1,0mM EDTA, рН 7,0) в умовах рідкого азоту Після проведення гомогенізації проводиться фенольне виділення та очистка загальних нуклеїнових кислот та два цикли целюлозного (Whatman CF-11) фракціонування, що включають декілька стадій використовуючи 16% розчин етанолу Фракцію длРНК після целюлозного фільтрату переводять на STE буфер без етанолу і концентрують в двох об'ємах охолодженого 95% етилового спирту та 0,1 об'єму 0,2М натрій ацетату, рН 5,5 Проводять ресуспендування в STE буфері Отримані проби в КІЛЬКОСТІ 40МКЛ на носять в індивідуальні кишені 6% поліакріламідного гелю (ПААГ) (1,5мм х 7см х 8см, 40 1 акриламід/бісакриламід), і поміщають на вертикальний прилад для електрофорезу ("BIORAD") Недоліком цього методу являється затяжна (О о> о ю ю методика виділення та фракціонування нуклеїнових кислот, і як наслідок, нерідко втратою (відмиванням) длРНК вірусного походження, і також невизначений час для проведення електрофорезу очищених длРНК, який значно варіює для різних типів вірусів рослин Винаходом ставиться завдання використовуючи модифікований власно метод целюлозної хроматографії та електрофорезу в 6% поліакріламідному гелі проводити діагностику та ідентифікацію РНК вмісних фітовірусів шляхом виділення специфічної проміжної вірусної форми дволанцюгової РНК (длРНК) на стадії и біосинтезу Поставлене винаходом завдання досягається тим, що у способі діагностики та ідентифікації РНК вмісних фітовірусів, що включає відбір рослинного зразку (уражені ділянки листя, стебел, коренеплодів, насіння тощо), гомогенізацію в буферному розчині STE (0,1 М NaCI, 0.05M tns-HCI, 1,0mM EDТА, рН 7,0) в умовах рідкого азоту, фенольне виділення та очистку загальних нуклеїнових кислот та цикли целюлозного (Whatman CF-11) фракціонування, в декілька стадій з використанням 16% розчину етанолу, переведення фракції длРНК після целюлозного фільтрату на STE буфер без етанолу і концентрування в двох об'ємах охолодженого 95% етилового спирту та 0,1 об'єму 0,2М натрій ацетату, рН 5,5, проведення ресуспендування в STE буфері, нанесення отриманих проб в КІЛЬКОСТІ 40мкл в індивідуальні кишені 6% поліакріламідного гелю (ПААГ) (1,5мм х 7см х 8см, 40 1 акриламід/бісакриламід), і поміщення на вертикальний прилад для електрофорезу ("BIORAD"), згідно винаходу, після першого фенольного виділення загальних нуклеїнових кислот проводять стадію першого низькошвидкісного центрифугування при понижених обертах кутового ротору з 8 000д до 6 000д, проводять тільки одну стадію градієнта целюлози для дволанцюгових рибонуклеїнових кислот з досліджуваного зразку, отримують зразки для електрофорезу, проводять ресуспендування кінцевої фракції длРНК після целюлозного градієнту в 200мкл STE буферу, проводять електрофорез при напрузі 100V протягом 3,5 годин з КІЛЬКІСТЮ зразків в ЗО - 40мкл, до детального розділення вірусних длРНК для всіх типів вірусів в залежності від молекулярної маси та розмірів Приклад виконання способу Для виділення та ідентифікації длРНК вірусів використовували проби рослин цукрового буряку (Beta vulgans), що були відібрані за ЗОВНІШНІМИ симптомами ураження вірусами з агроценозів Київської області України Для гомогенізації рослин 55096 них зразків масою 3,5г використовували буферний розчин STE (0,1 М NaCI, 0.05M tns-HCI, 1,0mM EDТА, рН 7,0) Виділення та очистку нуклеїнових кислот проводили класичним фенольним методом Здійснювали два цикли целюлозного (Whatman CF-11) фракціонування, що включали кілька стадій, використовуючи 16% розчин етанолу Фракцію вірусних длРНК після целюлозного фільтрату переводили на STE буфер без етанолу і концентрували в двох об'ємах охолодженого 95% етилового спирту та 0,1 об'єму 0,2М натрій ацетату, рН 5,5 Проводили ресуспендування в 200мкл STE буфері Отриману пробу в КІЛЬКОСТІ ЗО - 40мкл переносили в індивідуальні кишені 6% поліакріламідного гелю (ПААГ) розмірами 10 х 8см, що був поміщений для розгонки на вертикальний прилад для електрофорезу "BIORAD" Як молекулярний маркер для визначення розмірів длРНК використовували ДНК фага лямбда після обробки ферментами EkoR1 та Hind III Робоче розведення маркера для електрофорезу становило 8мкл Електричний струм встановлювали на 100В протягом 3,5 год Запропонована власна модифікація даного методу базується на прискоренні стадії целюлозно-хроматографічної очистки нуклеїнових кислот і фракціонування длРНК Запропоновано проводити стадію першого низькошвидкісного центрифугування при понижених обертах кутового ротору з 8 000д до 6 ОООд Таке центрифугування проводиться згідно методики після першого фенольного виділення загальних нуклеїнових кислот Надалі запропоновано проводити тільки одну (замість двох) стадію градієнта целюлози для дволанцюгових рибонуклеїнових кислот з досліджуємого зразку В результаті першої модифікації методу в досліджуємому зразку зберігається більша КІЛЬКІСТЬ загальних нуклеїнових кислот При проведенні їх целюлозно-хроматографічної очистки в наступному можливо за одну стадію провести фракціонування та виділення длРНК, Ідентифікація фрагментів длРНК фітовірусів являється сталою для конкретних представників фітовірусних груп і являє собою як діагностичний метод, так і метод ідентифікації РНК вмісних фітовірусів, стадій їх передачі переносчиками (гриби, комахи, нематоди тощо), а також для вивчення відмінностей ІЗОЛЯТІВ РНК вмісних фітовірусів Великого використання модифікована методика може мати при проведенні фітосанітарного контролю рослин на інфікування фітовірусами, для карантинної служби, української митниці, при експорті та імпорті рослинних об'єктів (насіння, живців, прищеп тощо) Підписано до друку 03 04 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24