Спосіб діагностики диктіокаульозу великої рогатої худоби

Спосіб діагностики диктюкаульозу великої рогатої худоби, що включає виявлення в досліджуваних зразках (пробах фекалій) специфічних фрагментів нуклеїнових кислот (ДНК) за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і двох штучно синтезованих олігонуклеотидів (праймерів), які дозволяють багаторазово копіювати специфічні ділянки ДНК інфекційних агентів при певних температурних і часових параметрах та КІЛЬКОСТІ циклів, який відрізняється тим, що підбирають індивідуальні параметри ампліфікації і ПОСЛІДОВНІСТЬ нуклеїнових кислот 5TCGTCTGCTGCTTTATGATGTTG З', Винахід відноситься до ветеринарної медицини, зокрема до ветеринарної паразитології Відомий метод полімеразної ланцюгової реакції розроблений американським біохіміком фірми "Cetus" Кери Мюллісом (Mulhs К В , Falona F A , Scharf S et al // Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology — NewYork, 1986 — P 263 273) Зажиттєвий діагноз на диктюкаульоз жуйних на СЬОГОДНІШНІЙ день ставлять на основі гельмінтоларвоскопічного дослідження фекалій методами Вайда, Бермана-Орлова, Котєльнікова-Хрєнова, які були запропоновані на початку 20-го століття Ці методи не завжди дають можливість виявити личинок диктюкаул через характерну біологічну особливість збудника Dictyocaulus viviparous Адже в період линьки личинки стають нерухомими і не завжди із проб фекалій виділяються у воду Винаходом ставиться завдання створити новий метод діагностики диктюкаульозу великої рогатої худоби Поставлене винаходом завдання досягається тим, у способі діагностики диктюкаульозу великої рогатої худоби, що включає виявлення в досліджуваних зразках (пробах фекалій) специфічних фрагментів нуклеїнових кислот (ДНК) за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і двох штучно синтезованих олігонуклеотидів (праймерів), які дозволяють багаторазово копіювати специфічні ділянки ДНК інфекційних агентів при певних температурних і часових параметрах та КІЛЬКОСТІ циклів, згідно винаходу, підбирають індивідуальні параметри ампліфікації і ПОСЛІДОВНІСТЬ нуклеїнових кислот 5'CCGTCTGCTGCTTTATG ATGTTG 3', 5'CGCCGTCTTCTTATATCGTCGTCG 31 для збудника диктюкаульозу великої рогатої худоби (Dyctiocaulus viviparus) Приклад Пробу фекалій (1 гр) поміщують у пластикову пробірку і додають 500мкл дистильованої води Суміш струшують і центрифугують, після чого проводять виділення ДНК набором реагентів для виділення ДНК Отриману чисту ДНК (3 - 5мкл) переносять в іншу пробірку і додають 15мкл ПЛРбуфера, 2 5мкл dNTP, по 2 5мкл праймерів, 0,25мкл Tag-полімерази і 1 краплю мінерального масла Вміст пробірки струшуємо і центрифугуємо, а потім помішуємо в ампліфікатор " Терцик ", якому задаємо програму 5'CGCCGTCTTCT1ATATCGTCGTCG 31 для збудника диктюкаульозу великої рогатої худоби (Dyctiocaulus viviparus) Температура, °С 95 94 65 72 94 65 72 74 Час 4хв 1 хв 1 хв 1 хв 30с 20с 40с 5хв К-ть циклів 1 5 35 1 ю 1^ о о (О З 60075 4 Детекція результату проводиться в 1% агарозРезультат ПЛР може бути оцінений візуально ному гелі з барвником - бромистим етідієм В гепо наявності смужок, що відповідають продуктам леві лунки вносять 10 - 12мкл ампліфікованої реакції суміші Після проведення електрофорезу фрагВинахід може бути застосований у ветерименти ДНК згруповуються в смужки, які виявляють нарній медицині для ранньої діагностики флуоресцентно диктюкаульозу великої рогатої худоби Комп'ютерна верстка А Крулевський Підписано до друку 06 10 2003 Тираж 39 при м Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна