Спосіб ідентифікації генотипів соняшника

Винахід належить до біотехнології, а саме до використання ДНК-маркерів в селекції та насінництві соняшника. Генетична формула генотипа може розглядатися як надійний та об'єктивний критерій для точної ідентифікації інбредних ліній та гібридів соняшника, контролю генетичного матеріалу на усіх етапах селекції та у процесі насінництва, а також для захисту прав авторів селекційних форм. Найбільш близьким до винаходу, що заявляється, є спосіб ідентифікації по електрофоретичним спектрам запасного білку соняшника - геліантинину (Анисимова И.Н. Идентификация сортов, линий и гибридов по составу полипептидов гелиантинина. Сборник научных трудов по прикладной ботанике, генетике и селекции. Т.114. Белковые маркеры в сортовой идентификации и регистрации генетических ресурсов культурных растений. Ленинград, 1987. С.114-126.). У відповідності з даним способом виділяють геліантинини з індивідуальних насінин, дісоціюють білкові молекули, проводять електрофорез у поліакриламідному гелі. Після фарбування гелів аналізують компонентний склад геліантининів та записують його у вигляді літерно-цифрової формули, де літера позначає належність компонента до кислих чи лужних поліпептидів, а цифра є порядковим номером компонента. Даний спосіб вибрано як прототип. До недоліків даного способу треба віднести слідуючі: наявність геліантинину дише в насінні; незначний рівень поліморфізму у комерційних генотипів соняшника за локусами, що кодують геліантинини, тобто більшість інбредних ліній є практично однорідними за спектрами геліантининів. З метою усунення вказаних недоліків пропонується спосіб ідентифікації генотипів соняшника, що базується на встановленні алельного складу ліній та гібридів за мікросателітними локусами геному соняшника. В основу винаходу поставлено задачу ідентифікації і реєстрації інбредних ліній і гібридів соняшника у вигляді генетичної формули генотипа за результатами ПЛР-аналізу мікросателітної ДНК, що дозволить підвищити точність ідентифікації та створити реєстраційний каталог генотипів соняшника. Поставлена задача вирішується за допомогою електрофорезу в 10% поліакриламідному гелі продуктів ампліфікації мікросателітних локусів геному соняшника та запису формули, що включає інформацію про характерні для кожного аналізуємого генотипа алелі по відповідним локусам. Відмінними від прототипу ознаками в винаході, що заявляється, є: - можливість проводити ідентифікацію генотипа на будь-якій стадії розвитку рослини, - спосіб підготовки зразків до аналізу, - показник, по якому ідентифікують генотипи. Спосіб забезпечує високу точність, надійність та унікальність ідентифікації генотипів. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю заявлених ознак та досягнутим результатом (підвищення точності, надійності та унікальності ідентифікації) можна пояснити так. Аналіз мікросателітів дозволяє отримувати стабільні кодомінантні маркери за умов використання будь-якої частини рослини та на усякій стадії її розвитку. Мікросателітні локуси є високополіморфними в геномі соняшника, тому набір алелів за кількома такими локусами є унікальною характеристикою генотипа. Спосіб здійснюється таким чином. 1. Виділення ДНК. Сегменти насіння, паростків, листків або коріння соняшника гомогенізувати в 1,5 млпробірках в лізуючому буфері (20,0мМ Na3EDTA, 0,1М тріс-НСl рН8,5 при 25°С, 1,4М NaCl, 2,0% СТАВ) до повної мацерації тканин. Лізат інкубувати 45хв. при 60°С. Додати рівний об'єм суміші хлороформ-ізоаміловий спирт (24:1 за об'ємом), перемішати до утворення білої емульсії. Центрифугувати 5 хв при 14000об./хв. на мікрофузі "Eppendorf 5415", водну фаз у перенести в чисті пробірки та додати рівний об'єм ізопропілового спирту, перемішати, осадити ДНК центрифугуванням при 10000 об./хв. протягом 4хв на мікрофузі "Eppendorf 5415". Осадок промити двічі 0,5мл 70% етанола, центрифугувати при 10000об./хв. протягом 4хв на мікрофузі "Eppendorf 5415". Осадок ДНК підсушити при кімнатній температурі 15хв та розчинити в 0,3мл ТЕ-буфер у (10,0мМ трис-НСl, 1,0мМ ЕДТА). 2. Проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). ПЛР проводити на приладі "Терцик" ("ДНК-технологія", Росія). Вміст реакційної суміші для проведення ПЛР об'ємом 20мкл: 50мМ КСl, 20мМ тріс-НСl (рН 8,4 при 25°С), 0,01% Tween-20, 2мМ MgCl2, 0,2мкМ праймеру, 200 мкМ кожного dNTP, 20 нг геномної ДНК, 1 од. Taq полімерази. Ампліфікація: денатурація - 94°С - 2хв., далі - 40с.; відпал - 60°С - 30с. - 35 циклів; синтез - 72°С 2хв.; елонгація - 5хв. В таблиці наведено інформацію про мікросателітні локуси геному соняшника та послідовності праймерів для ампліфікації ДНК за даними локусами. Таблиця Мікросателітні локуси соняшника та послідовності праймерів для їх аналізу Послідовність прямого (П) та зворотного (З) праймерів (5'-3') ORS 78 (А) П GTTCGTCGAGTAC ATGTTCTGC З TTTCCCTCTGGAAAGTTGTCA П CAACGAAAAGAC AGAATCGAAA ORS 509 (В) З CCGGGAATTTTACAAGGTGA ORS 595 (С) П CTCACCTGCCTCCATCTCTC З ATCCCGCAC ATACC AAGTGT П GGAAAGC AGC AATGGTTC ATAA ORS 815 (D) З CACCAAGTGC AAACCCTAGAAA ORS 3 (Е) П AGAACTGGC AGCTTGGAAAA З GTCCAAATGGTGGAAAACTAC Локус (код) ORS 4 (F) Ha 1796 (G) На 1608 (Н) П З П З П З AC AAGTCGGCTGGTGAGC AC ATGAAAC ACGAGCTAAACC CGAAGGAAGGAACCTGCCTC CCATACGCGTTTACTTCTC AGG GATCTTAGGTCCGCCAC GATGGC ATTTGGCTAGAC 3. Електрофоретичний розподіл продуктів ампліфікації. Оцінювати продукти ампліфікації (5 мкл-аліквоту ПЛРсуміші) у 10 % денатуруючому поліакриламідному гелі. Склад гелю: 10% акриламід, 7М мочевина, 1х ТВЕ-буфер (50мМ тріс-Н 3ВО3, 2мМ ЕДТА, рН8,0). Умови електрофорезу: напруга 500V протягом 90хв. при 65°С. Для .приготування одного гелю необхідно змішати 12,5мл 8М сечовини, 12,5мл розчину 30% поліакриламіду з 8М сечовиной, 2,5мл 10 х ТВЕ-буфер у, 25мкл ТМЕД, 50мкл 10% ПСА. Для контролю за просуванням фрагментів ДНК в гелі зразок змішати з 1 мкл денатуруючого буфера для нанесення (98% формамід, 10мМ ЕДТА рН8,0, 0,2% (w/v) бромфеноловий синій, 0,2% (w/v) ксиленціанол) та денатурува ти протягом 1,5хв при 95°С, після чого швидко охолодити на льодяній бані та за допомогою шприца нанести в лунку гелю. Одна доріжка гелю повинна містити зразок ДНК з відомою молекулярною вагою. Як стандарт молекулярної маси використовувати ДНК pUC19, рестриктовану MspІ. 4. Візуалізація продуктів ампліфікації. Поліакриламідний гель фарбувати відповідно до методики: гель покласти на 5хв у 10% етанол, перенести у 1% НNО3 на 3хв. Гель промити кілька разів дистильованою водою. Витримати 20хв у 0,012М AgNO3 у темряві, промити кілька разів дистильованою водою. Інкубува ти гель у відновлюючому розчині (0,28М Na2CO3 (безводний), 0,019% формалін), змінюючи розчин у кожному разі його потемніння, до появи забарвлення фрагментів ампліфікації. Промити кілька разів бідистильованою водою. Гелі зберігати між двома листами прозорої поліетиленової плівки. 5. Документування отрішанних електрофореграм. Документувати отримані електрофореграми відеосистемою VDS ("Amersham Pharmacia Biotech"). Молекулярну вагу поліморфних фрагментів ДНК встановлювати за допомогою комп'ютерної програми "Image Master ID Elite" згідно стандарту молекулярної ваги. 6. Запис ідентифікаційної формули. За результатами аналізу мікросателітних локусів записати для аналізуємого генотипу характерний для нього набір алелів в вигляді формули, де латинськими літерами позначити коди локусів, а у нижніх індексах цифрами - розміри відповідних локусам алелів (в парах нуклеотидів). Приклади конкретного використання запропонованого способу. Приклад 1. Запис ідентифікаційної формули для інбредної лінії Од1036. Для дослідження брали насіння лінії Од1036, виділяли ДНК, проводили електрофорез у 10% поліакриламідному гелі продуктів ампліфікації за 8 мікросателітними локусами (вказані в таблиці). Інбредна лінія Од1036 є гомозиготною за всіма дослідженими локусами. Записали набір алелів, використовуючи коди локусів та розміри відповідних їм алелів. А216 В204 C 179 D175 Е 223 F 172 G 165 H228 Приклад 2. Запис ідентифікаційної формули для гібрида Од123. Для дослідження брали насіння гібриду Од123, виділяли ДНК, проводили електрофорез у 10% поліакриламідному гелі продуктів ампліфікації за 8 мікросателітними локусами (вказані в таблиці). Гібрид Од123 є гомозиготним за локусами ORS 3, ORS 4, ORS 509 та гетерозиготним за локусами ORS 78, ORS 595, ORS 815, На 1796, На 1608. Записали набір алелів, використовуючи коди локусів та розміри відповідних їм алелів. А204 А216 В 204 C185 C 140 D175 D190 Е223 Е 196 F 172 G 252 G 165 Н228 H263