Спосіб ідентифікації личинкової стадії trichinella spiralis в м’язовій тканині тварини та специфічний барвник для забарвлення капсули личинки (варіанти)

Винахід відноситься до ветеринарної медицини, а саме до ідентифікації личинкової стадії Trichinella spiralis в м'язовій тканині тварин. Інфекційний агент Trichinella spiralis є збудником захворювання трихінельозом тварин і людей. Причиною трихінельозу, наприклад у тварин, є надходження в їх організм личинок нематоди Trichinella spiralis, інвазії якої широко розповсюджені в природі в популяціях хижаків, усеїдних тварин і гризунів. Личинки Trichinella spiralis стійки до дії низьких температур і в трупах тварин переносять навіть арктичні зими. Однак у даний час спалахи трихінельозу спостерігаються в районах, де раніше він практично не реєструвався. Це пов'язано із широким розвитком індивідуального тваринництва, що нерідко ведеться без дотримання санітарно-ветеринарних правил догляду за тваринами. Життєвий цикл трихінели, на відміну від більшості гельмінтів, відбувається в організмі одного хазяїна. У шлунку людини або тварини капсула личинки перетравлюється шлунковим соком, і личинка мігрує в тонку кишку, де відбувається її дозрівання, запліднення самок і продукціювання нових личинок, що зі струмом крові і лімфи розносяться потім по різних органах і тканинам. Основна кількість личинок осідає і інцистирується в кістяковій мускулатурі, зберігаючи життєздатність протягом багатьох років. Паразитологічна діагностика трихінельозу заснована на дослідженні біоптатів м'язової тканини за допомогою трихінелоскопії. Цей метод широко застосовується при перевірці м'яса тварин службами санепіднагляду, однак для прижиттєвої діагностики використовується вкрай рідко. Існує два способи для післяубойної діагностики трихінельозу, а саме мікроскопічний (компресорний) та біохімічний (спосіб перетравлення). Порівняльний аналіз цих способів показує, що спосіб переварювання є більш трудомістким але і більш надійним. При проведенні трихінелоскопії за способом перетравлення використовують штучний шлунковий сік (ШШС), що є сумішшю води (1000см3), концентрованої соляної кислоти та пепсину. До ШШС додають подрібнену масу м'язів досліджуваних тварин, витримують цю суміш протягом 5 - 7 годин при температурі 41 42 град С. Після чого осад піддають дослідженню на наявність трихінел за допомогою диференціальної діагностики [1]. Капсульованих трихінел необхідно диференціювати від утворень, що найбільш часто зустрічаються в м'ясі і м'ясопродуктах саркоцист (мішерові мішечки) і мікрофін. Диференціація заснована на морфології збудника і будівлі капсули. Трихінели мають капсулу лимоновидної, округлої форми, усередині спірально згорнута личинка (або декілька личинок). Саркоцисти мають власну оболонку циліндричної або неправильної форми; циста укладена у власну тонку оболонку і складається з камер, усередині яких знаходяться мерозоіти. Мікрофіни на відміну від трихінел розташовуються між м'язовими волокнами, мають овальну форму й оточені шаруватою оболонкою. Результати вважають позитивними, якщо в зразках дослідженої продукції виявлена хоча б одна личинка капсульних або безкапсульних трихінел. Недоліком цього способу є те, що він потребує складної диференціальної діагностики, яка в значній мірі залежить від суб'єктивного фактору людини, що здійснює діагностику. В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб ідентифікації личинкової стадії Trichinella spiralis в м'язовій тканині тварини, який включає виготовлення штучного шлункового соку (ШШС) шляхом змішування води, концентрованої соляної кислоти та пепсину після чого до ШШС додають подрібнену масу м'язів досліджуваної тварини, витримування цієї суміші, відділення осаду із суміші і досліджують його на наявність трихінел, відповідно до винаходу, виготовлення ШШС проводять шляхом додавання до води (1000см3) з температурою 37 - 62 град С соляної кислоти концентрації 25 - 35,7% (8 - 13мл), пепсину з активністю 20 4000U/мг у кількості відповідно 0,62 - 125,0г, змішують подрібнену масу м'язів досліджуваної з ШШС і витримують 0,3 - 1,0 години, після чого до осаду витриманої суміші додають 0,2 - 10,0мл специфічного барвника і проводять мікроскопічні дослідження на наявність трихінел. До теперішнього часу не знайдено жодного способу виявлення личинок Trichinella spiralis де б використовувалися специфічні барвники. Відомі області медицини де використовуються контрастні речовини (специфічні барвники), а саме це томографія, контрастна рентгенометрія та інші [2]. Використовується ця речовина шляхом введення в організм людини з послідуючим проведенням інструментальної діагностики - рентгенівської, томографічної. Недоліком виявлених контрастних речовин (специфічних барвників) є те, що вони не фарбують оболонку Trichinella spiralis. Вимогою до специфічних барвників є те, що він повинен вступати в хімічну реакцію виключно з оболонкою личинки Trichinella spiralis і бути інертним до речовини, що її оточують. Серед існуючих хімічних речовин були знайдені такі, що відповідають вище згаданим вимогам. В основу винаходу поставлено задачу застосувати використання специфічного барвника для забарвлення капсули личинки Trichinella spiralis, що дає можливість забезпечити якісну та надійну діагностику наявності личинки Trichinella spiralis в м'язах тварин. Поставлена задача вирішується при застосуванні розчинів сафроніна, метиленового синього, амідо чорного, генціанвіолета та фуксина, як специфічних барвників для забарвлення капсули личинки Trichinella spiralis при її ідентифікації в м'язах тварини за способом перетравлення. Кожний із зазначених розчинів готується по відомим з хімічних довідникам технологіям [3]. Відомо, що розчин сафроніна використовується для забарвлення некробацил, розчин метиленового синього використовується для визначення сульфатних груп мукополісахаридів, розчин амідо чорного для забарвлення гістологічних зрізів. Технічний результат досягається за рахунок того, що хімічний склад заявлених специфічних барвників такий, що дозволяє вступати в хімічну реакцію тільки з оболонкою трихінели, а при цьому залишає не забарвленим решту аналізуємої речовини. Заявлені розчини специфічних барвників дають слідуючі кольори забарвлення оболонки Trichinella spiralis: сафроніну - червоний; метиленового синього - синій; амідо чорного - голубий; генціанвіолета - фіолетовий та фуксина - малиновий. В цьому є його специфічність. Таким чином в заявленому способі та з використанням, як специфічних барвників, ряду відомих в іншому використанні хімічних речовин, що виключає потребу в диференціальній діагностиці, при цьому визначення капсульованої личинки Trichinella spiralis є стовідсотковою. Заявлений спосіб реалізується слідуючим чином. Підготовчі роботи. Необхідне обладнання та реактиви: мікроскоп; магнітна мішалка з підігрівачем; капронове сито з діаметром вічок 400мкм; чашки Петрі або предметні скельця; тепла водопровідна вода (37 - 62°С); м'ясорубка; хімічний стакан з плоским дном ємністю 2 літри; мірна лійка з краником; скляні піпетки; пепсин; соляна кислота Пепсин це фермент тваринного походження. В залежності від виду тварини, з якої його виробляють та способу його отримання пепсин може мати різноманітний вид (колір, розмір часток порошку та активність). Пепсин може поставлятися з активністю 20 - 4000U/мг. Перед початком роботи компоненти набору необхідно витримати при температурі від 18 до 22°С протягом 30 хвилин. Проведення аналізу. Від 50 свинячих туш відбирають 50 проб м'язів ніжок діафрагми, від кожної із проб беруть по 1г м'язів, звільнених від жиру, фасцій, крові, роблять фарш, який поміщають у 2-літровий хімічний стакан з плоским дном. В стакан з 1л теплої водопровідної води (37 - 62°С), при перемішуванні висипають пепсин, наприклад, з активністю 600U/мг, у кількості 4,2г та додають розчин соляної кислоти, наприклад з концентрацією 32%, 9,8мл. Отриманий штучний шлунковий сік виливають в стакан із фаршем та ставлять на магнітну мішалку з підігрівом. Перетравлення проводять при температурі 37 - 62°С протягом 0,3 - 1,0 год. Одержаний перевар фільтрують через капронове сито, яке зафіксоване у лійці з краником. Фільтрат в лійці відстоюють 30 хв., відбирають 40мл осаду у мірний стаканчик, який знову відстоюють 10 хв., 30мл надосадової рідини обережно зливають або відбирають піпеткою, а в решту фільтрату додають 0,2 - 10,0мл специфічного барвника, наприклад розчин сафроніну або розчин метиленового синього, або розчин амідо чорного, або розчин генціанвіолета, або розчин фуксина, витримують 5 хвилин виливають у бактеріологічну чашку і досліджують під малим збільшенням мікроскопа. Якщо личинки мають місце в збірній пробі, то вони фарбуються від специфічного барвника у відповідний до використованого барвника колір. Інвазовану тушу виявляють методом виключення. Джерела інформації: 1. Методические указания по лабораторной диагностики трихинеллеза животных, Утв. Департаментом ветеринарии РФ, № 13-7-2/1428 от 28.10.98г. 2. Медицинская энциклопедия, М., 1978, С. 328 - 330. 3. Химическая энциклопедия, Изд. «Сов. Энциклопедия», М., 1965, С. 267 - 271.