Спосіб визначення пероксидної резистентності еритроцитарних мембран

Спосіб визначення пероксидної резистентності еритроцитарних мембран, що включає додавання реагентів до суспензії еритроцитів, інкубацію проб, центрифугування, спектрофотометрування супернатантів з подальшим визначенням відсотку гемолізованих еритроцитів, який відрізняється тим, що до суспензії еритроцитів в кожну пробу додають реагент для інгібування каталазної активності Винахід відноситься до медицини і може бути використаний в науково-дослідних лабораторіях для проведення експериментальних робіт і в КЛІНІЧНИХ лабораторіях для діагностики ранніх морфофункцюнальних та фізико-хімічних змін еритроцитарних мембран Зменшення резистентності еритроцитарних мембран під дією подразнюючих впливів екзоі/або ендогенної природи є наслідком пошкодження метаболічних шляхів збереження і оновлення ЛІПІДНОГО компоненту, ліпід-білкових взаємодій та регулювання цих шляхів, що призводить до нестабільності мембран та гемолізу еритроцитів Міра не насиченості жирно кислотних залишків в молекулах фосфоліпідів та вміст холестерину, в основному, визначають плинність біологічних мембран 3 іншого боку, ненасичені жирно кислотні структури є основним субстратом перекисного окислення ЛІПІДІВ (ПОЛ) бюмембран, тому резистентність еритроцитів визначається також забезпеченістю їх складовими антиоксидантного захисту, як ферментативного, а саме, супероксиддисмутазою, каталазою, системою глутатюнового комплексу, та не ферментативного вітамін Е, тощо Поряд з цим, для повноцінної утилізації активних форм кисню необхідний збалансований обмін речовин, який в еритроцитах обмежений анаеробним ГЛІКОЛІЗОМ та гексозомонофосфатним шляхом ВІДОМИЙ спосіб визначення резистентності еритроцитів під впливом розчина пероксиду водню /Покровский А А, Абраров А А К вопросу о перекисной резистентности эритроцитов // Вопр питания - 1964 - Т 23, №6 - С 44-49 / пробы центрифугируют Під пероксидною резистентністю еритроцитів потрібно розуміти їх гемолітичну СТІЙКІСТЬ під впливом певних концентрацій пероксиду водню у фізіологічному розчині Цей показник знаходиться у зворотній залежності по відношенню до ступеня гемолізу, що визначається за стандартних умов досліду Суть способу зводиться до визначення процента еритроцитів, що гемолізуються за стандартних умов під впливом Н2О2 Кров вводять у мікро центрифугальну пробірку, що містить цитрат фізіологічного розчину, та центрифугують Центрифугат зливають, а осад заливають буферно-фізюлопчним розчином, що готують змішуванням рівних об'ємів фізіологічного розчину хлориду натрію та фосфатного буфера Після інкубації еритроцитну завись знову центрифугують і до осаду еритроцитів додають фізіологічний розчин, при цьому утворюється суспензія еритроцитів Для визначення пероксидної резистентності в 4 пробірки вносять приготовлені суспензії В перші 3 проби додають розчини пероксиду водню у фосфатному буфері, а в четверту пробірку - того ж буферного розчину Всі проби шкубують в термостаті, а потім витримують при кімнатній температурі протягом 2 годин Після ЦЬОГО В усі пробірки, крім третьої, наливають буферно-фізіологічний розчин, а в третю для одержання повного гемолізу додають дистильованої води Всі проби центрифугують Ступінь Тому, визначення резистентності еритроцитарних мембран до дії пероксиду водню є відображенням комплексу метаболічних змін еритроцитів та має виключну діагностичну ЦІННІСТЬ ю о о> ю 59052 гемолізу визначають спектрофотометруванням супернатантів з подальшим визначенням відсотку гемолізованих еритроцитів Про пероксидну резистентність еритроцитів судять по ступені гемоліза, яка викликана під впливом розчина пероксида водню Недоліком відомого способу є те, що не забезпечується можливість оцінити реальну КІЛЬКІСТЬ гемолізованих еритроцитів, враховуючи відсоток від величини повного гемолізу і тому не досягається точність способу Окрім того тривалості визначення перекісної резистентності еритроцитарних мембран дуже велика до 3-х годин В основу винаходу поставлене завдання удосконалення способу визначення пероксидної резистентності еритроцитарних мембран, в якому додавання реагенту для інгібування каталазної активності забезпечує можливість оцінити реальну КІЛЬКІСТЬ гемолізованих еритроцитів, враховуючи відсоток від величини повного гемолізу і завдяки цьому досягається підвищення точності способу та зменшення тривалості визначення перекісної резистентності еритроцитарних мембран Поставлене завдання вирішується тим, що в способі визначення пероксидної резистентності еритроцитарних мембран, що включає додавання реагентів до суспензії еритроцитів, інкубацію проб, центрифугування, спектрофотометрування супернатантів з подальшим визначенням відсотку гемолізованих еритроцитів, згідно винаходу до суспензії еритроцитів в кожну пробу додають реагент для інгібування каталазної активності Суть методу полягає у визначенні відсотку гемолізованих еритроцитів під дією пероксиду водню Для цього кров у КІЛЬКОСТІ 0,25мл з розчином цитрату натрію (2 краплі 0,2М розчину) змішували з бмл ІЗОТОНІЧНОГО фосфатного буферу (рН-7,4) Центрифугували 10 хвилин при 1500об/хв Осад еритроцитів резуспензували в 2мл ІЗОТОНІЧНОГО фосфатного буферу Для визначення перекісної резистентності в 4 пробірки вносили по 0,25мл суспензії еритроцитів і у кожну додавали по 0,08мл 4мМ буферного розчину азиду натрію (для пригнічення каталазної активності) та шкубували ЗО хвилин при 37°С Надалі, у перші три пробірки додавали по 0,17мл ЗОмМ буферного розчину пероксиду водню, а у четверту ту ж КІЛЬКІСТЬ ІЗОТО НІЧНОГО фосфатного буферу Всі пробірки шкубували одну годину при 37°С Надалі, у 1-шу, 2-гу і 4ту пробірки додавали по 4,5мл ІЗОТОНІЧНОГО фосфатного буферу, а у 3-тю, для отримання повного гемолізу, - 4,5мл бідистильованої води Всі пробірки центрифугували 10 хвилин при 1500об/хв Супернатант відбирали для визначення міри гемолізу еритроцитів колориметричним способом (при довжині хвилі 540нм) Комп'ютерна верстка М Мацело Відсоток перекидного гемолізу визначали згідно формули, враховуючи відсоток від величини повного гемолізу, середнє арифметичне двох паралельних проб та похибку при введенні азиду натрію Еі+Е2 «100 Е3-Е4 де А - міра гемолізу під дією Н2О2 (у %), Еі 2 - оптична ЩІЛЬНІСТЬ двох паралельних дослідних проб, А= Ез - оптична ЩІЛЬНІСТЬ ДОСЛІДНОЇ проби, при повному гемолізі, Е4 - оптична ЩІЛЬНІСТЬ контрольної проби, при введенні азиду натрію Спосіб визначення резистентності еритроцитарних мембран до дії пероксиду водню спрощує проведення аналізу, скорочує час визначення у 2 рази внаслідок застосування азиду натрію (порівняно з методом за Покровським А А , 1964) Представлений спосіб розрахунку дає можливість оцінити реальну КІЛЬКІСТЬ гемолізованих еритроцитів, враховуючи відсоток від величини повного гемолізу Запропонований метод визначення відсотку гемолізованих клітин за вмістом гемоглобіну в надосадному шарі (Денисович В И , 1973) може бути неточним, оскільки дія пероксиду водню поширюється не тільки на еритроцитарні мембрани, але й може призводити до руйнування структури гемоглобіну з утворенням продуктів його окислення та розпаду (Giuhvi С, Davies К , 1990, 2001) Приклад При досліджені крові потенційно здорових людей отримано, в середньому, такі величини оптичної ЩІЛЬНОСТІ ЕгО,О5, Е2-0,045, Е3-0,330, Е4-0,01, А=14%, отримані дані розраховували згідно формули 0,05 + 0,045 -0,01 «100 А= 0,330 - 0,01 При досліджені крові щурів контрольної групи, величина перекісного гемолізу становила в середньому 9,5% Чутливість методу ілюструє той факт, що при введені тваринам токсичних доз нітриту натрію, величина перекісного гемолізу зросла в середньому до 15,5% Застосування запропонованого способу забезпечує підвищення точності способу та скорочує тривалість визначення у 2 рази з 3-х годин до 1 год ЗОхв Досягається можливість оцінити реальну КІЛЬКІСТЬ гемолізованих еритроцитів, враховуючи відсоток від величини повного гемолізу, середнє арифметичне двох паралельних проб та похибку при введенні азиду натрію Підписано до друку 05 09 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна