Штам перещеплюваних клітин нирки сірійського хом’ячка внк-21 clone 13/04

Штам перещеплюваних клітин нирки сірійського хом'ячка ВНК-21 clone 13/04 для репродукції вірусу сказу, родина Cricetidae, рід Mesocricetus, вид Mesocricetus auratus. Корисна модель відноситься до ветеринарної вірусології та біотехнології і може бути використана для вивчення та накопиченні вірусів Відома перещеплювана лінія клітин нирки сірійського хом'ячка ВНК-21 clone 13, яка була отримана в 1961 році в Англії (Macpherson, Stoker) з культури клітин нирки сірійського хом'яка ВНК-21 та підтримувалась в модифікованому середовищі Ігла (80%) з додаванням триптизофосфатного бульйону (10%) та сироватки крові великої рогатої худоби (ВРХ) (10%). Штам перещеплюваних клітин нирки сірійського хом'ячка ВНК-21 clone 13 через його культивування при нестандартних умовах і в різних за складом живильних середовищах, призвів до нестабільності культуральних, морфологічних, цитогенетичних характеристик культури та чутливості до вірусів В основу корисної' моделі поставлена задача одержання штаму перещеплюваних клітин нирки сірійського хом'ячка ВНК, який є стабільним за біотехнологічними характеристиками, що забезпечує високий рівень репродукції вірусу сказу свиней і придатний для науково-дослідної роботи та використання в біотехнології. Штам клітин ВНК-21 clone 13/04 отриманий з перещеплюваної лінії клітин нирки сірійського хом'ячка ВНК clone 13, адаптований до живильного середовища, яке включає рівне співвідношення середовищ Ігла DMEM, 199 та 10% сироватки крові великої рогатої' худоби, очищеної поліетиленгликолем, з одночасним добором високочутливих до вірусу сказу та морфологічно однорідної популяції КЛІТИН. Штам ВНК clone 13/04 зберігається у колекції клітинних культур Інституту експериментальної та клінічної ветеринарної медицини (ІЕКВМ) УААН за номером 32: родина Cricetidae, рід Mesocricetus, вид Mesocricetus auratus. Штам ВНК-21 clone 13/04 має такі властивості Морфологічні ознаки. Клітини мають епітеліоподібну чи фібробластоподібну (в залежності часу після пересіву) форму з округлими ядрами, що вміщують 2-8 дрібних ядерець різноманітної форми. Цитоплазма клітин гомогенно-дрібнозерниста Контури між клітинами чіткі, моношар прозорий Каріологічні ознаки. Кількість хромосом у клітинах коливається від 36 до 48, модальний клас відповідає 43-44 хромосомам, до яких відноситься 29% клітин популяції. Незначні зміни в каріотипі клітин ВНК-21 clone 13/04 у порівнянні з вихідним каріотипом сірійського хом'ячка відбулися за рахунок аберацій окремих хромосом та окремих транслокацій, що сталися в процесі адаптування їх до культивування in vitro з використанням нового складу живильного середовища. Умови культивування та ростові властивості. Середовище культивування1 суміш рівних об'ємів середовища 199 та Ігла DMEM з додаванням 10% сироватки крові ВРХ, очищеної поліетиленгликолем. Температура культивування 37°С, рН7,2-7,4. Кратність розсіву клітин (1'4)-(16), посівна концентрація 80-125тис. клітин в 1см3, інтервал пересіву 3-5 діб. На другу добу культивування кількість клітин зростає в 4 рази. Режим кріоконсервування. Суспензію клітин фасують в ампули у концентрації 5-7млн./см3 Як кріозахисне середовище використовують ростове середовище з додаванням 10% стерильного диме Ю О (О 6015 тил сульфоксиду (ДМСО) (димексиду). Консервують в ампулах, що запаяні, охолодженням на першому етапі зі зниженням температури 1°С/хвилину до -30°С, на другому - 10°С/хв. до 70°С, після чого переносять в рідкий азот. Режим відновлення. Ампули з клітинами, які зберігались у рідкому азоті, піддають відтаванню у водяній бані з температурою 39°С Розморожену клітинну суспензію переносять до стерильного флакону Подальшу процедуру «відмивання» клітин від кріопротекторів здійснюють шляхом додавання (по краплям) ростового живильного середовища (суміш рівних об'ємів середовища 199 та Ігла DMEM з 10% сироватки крові ВРХ без антибіотиків) до 50-100см3, після чого центрифугують. Визначають концентрацію живих та мертвих клітин в осаду, після чого готують посівну суспензію клітин у ростовому середовищі концентрацією 80-125тис. клітин у 1см3 та розливають у культуральні посудини. Через 24 години замінюють живильне середовище на свіже, що сприяє видаленню залишків кріопротектора Кріоконсервування впродовж 1-3 років не відбивається на зберіганні основних морфологічних, каріологічних характери Комп'ютерна верстка В. Мацело стиках та вірусрєпродуктуючих властивостях клітин ВНК-21 clone 13/04. Контроль штаму ВНК-21 clone 13/04 на сторонні контамінанти. При обстеженні клітин ВНК-21 clone 13/04 на наявність контамінантів (бактерій, грибів, мікоплазм) отримано негативні результати Видова ідентичність підтверджена цитогенетичним методом. Приклад використання ВНК-21 clone 13/04. Дослідження вірусу сказу (Таблиця). Таблиця Пасажний рівень культури клітин 10 ЗО 50 Титри накопичення вакцинного штаму вірусу сказу "Щелково 51"(k] ТЦЦ 50/смз) 6,4 6,4 6,5 Штам перещеплюваних клітин нирки сірійського хом'ячка ВНК-21 clone 13/04 забезпечує високий рівень репродукції вірусу сказу і є придатним для науково-дослідної роботи. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ-42,01601