Штам перещеплюваних клітин нирки вівці flk-sbbl, який продукує вірус лейкозу великої рогатої худоби

Штам перещеплюваних клітин нирки ВІВЦІ FLK-SBBL, який продукує вірус лейкозу великої рогатої худоби, депонований та зберігається за номером 18 у колекції клітинних культур Інституту експериментальної та клінічної ветеринарної медицини УААН, м Харків, Україна Винахід відноситься до ветеринарної вірусологи та біотехнологм і може бути використаний для вивчення (випробування) вірусу лейкозу великої рогатої худоби (ВРХ) та накопичення вірусної біомаси Метою винаходу є одержання нового штаму перещеплюваних клітин нирки ВІВЦІ, ЯКИЙ має стабільні культуральні та цитоморфолопчні властивості та високий рівень віруспродукуючої активності Штам FLK-SBBL одержували таким чином Культуру FLK-BLV(Van Der Maaten M J , Miller J Replication of bovine leukemia virus nn monolayer cultures//Bibl Haematol 1976 Vol 43 P 360 - 362) адаптували до культивування на середовищі Ігла та 199 з додаванням 10% сироватки ВРХ Після чого на протязі не менш 20 пасажів проводили відбір найбільш життєздатних клітин методом зменшення частоти пересівів Дворазове тонували культури методом розведення (Вихрев Н Е , Ямникова С С Культивирование in vivo и клонирование клеток мышиной гибридомы// Методы исследования в молекулярной, общей и медицинской вирусологии М , 1987 - С 123 - 124) та відбирали штам клітин, який відрізняється уніфікованими морфологічними ознаками та активною проліферацією Для наступного культивування брали матраци з повним моношаром та чіткою морфологічною структурою клітинних елементів (середовище культивування середовище 199 та середовище Ігла в співвідношенні 1 1,10% сироватки ВРХ, рН 7,2 - 7,4, температура 37°С) нальных антител (гибридомная технологиям/Методы культивирования клеток Л Наука, 1988, С 194-205) Штам FLK-SBBL зберігається у колекції клітинних культур Інституту експериментальної та клінічної ветеринарної медицини (ІЕКВМ) УААН під номером 18 родина Bovidae рід Ovis, вид Ovis anes Штам FLK-SBBL має такі властивості Морфологічні ознаки Клітини мають епітелюподібну форму з округлими ядрами та 2 - 7 дрібними ядерцями різноманітної форми Цитоплазма клітин є гомогенно-дрібнозернистою Контури між клітинами ЧІТКІ, моношар прозорий Часто у моношарі спостерігають утворення симпластів Карюлопчні ознаки КІЛЬКІСТЬ хромосом у клітинах коливається від 54 до 86, модальна група відповідає 73 - 75 хромосомам, до якої відноситься 28% клітин популяції Головні зміни в каріотипі клітин FLK-SBBL у порівнянні з нормальним каріотипом нирки ВІВЦІ відбуваються за рахунок анеуплоїдм та багатокількісних аберацій окремих хромосом, що були викликані вірусом лейкозу ВРХ Умови культивування та ростові властивості Середовище культивування суміш рівних об'ємів середовища 199 та Ігла MEM з додаванням 10% сироватки крові ВРХ без антибіотиків Температура культивування 37°С, рН 7,2 - 7,4 Кратність розсіву клітин (1 3) - (1 5), посівна концентрація 80 125тис клітин в 1 см 3 , інтервал пересіву 5 - 6 діб На третю добу культивування КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН зростає у 3 рази Режим крюконсервування Суспензію клітин фасують в ампули у концентрації 5 - 7млн /см3 Як Зняття здійснюють за допомогою підігрітого до 37°С 0,02%-ого розчину Версена без центрифугування (Фридлянская И И Получение монокло ю ю 55921 4 тиків), ДО 50 - 100см3, після чого центрифугують крюзахисне середовище використовують ростове Визначають концентрацію живих та мертвих середовище з додаванням 10% стерильного димеклітин в осаду, після чого готують суспензію клітин тилсульфоксиду (ДМСО) Консервують в ампулах, у тому самому ростовому середовищі з посівною що запаяні, охолодженням при температурі 4 - 6°С концентрацією 80 - 125тис клітин у 1 см 3 та розпротягом ЗО - 50 хвилин, після чого заморожують ливають у культуральні посудини Через 24 години до -ЗО - 40°С зі зниженням температури замінюють живильне середовище, що сприяє від1°С/хвилину і переносять в бюсховище з рідким даленню залишків крюпротектора Термін крюконазотом сервування 1 - 1 0 років не відбивається на зберіРежим відновлення Ампули з клітинами, які ганні головних морфологічних, карюлопчних зберігались в рідкому азоті, піддають відтаванню у характеристик та віруспродукуючих властивостей водяній бані з температурою 39°С Розморожену клітин FLK-SBBL клітинну суспензію переносять до стерильного флакону Подальшу процедуру «відмивання» кліПриклад використання штаму FLK-SBBL Дотин від крюпротекторів здійснюють додаванням слідження вірусу лейкозу ВРХ та вилучення його (по краплині) ростового живильного середовища антигену для діагностики лейкозу ВРХ за метода(суміш рівних об'ємів середовища 199 і Ігла MEM з ми імунодифузм (РІД) та імуноферментного аналідодаванням 10% сироватки крові ВРХ без антибюзу (ІФА) Підписано до друку 05 05 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24