Штам перещеплюваних клітин нирки вівці ро-2/04

Штам перещеплюваних клітин нирки вівці РО2/04 для репродукції вірусу діареї і інфекційного ринотрахеїту, родина Bovidae, рід Ovis, вид Ovis aries. Корисна модель відноситься до ветеринарної вірусології та біотехнології і може бути використана для вивчення біології вірусів та накопичення їх біомаси Відома лінія перещеплюваних клітин нирки вівці РО-2, яка отримана в 1965 році (Л Ф Груниной та Д.Ф Осидзе) і вирощується на живильному середовищі 0,5%-го гідролізату лактальбуміну з додаванням 10% сироватки крові великої рогатої худоби (ВРХ). Внаслідок культивування перещеплюваних клітин нирки вівці РО-2 в різних за складом живильних середовищах призвело до нестабільності культуральних, морфологічних, цитогенетичних характеристик клітин та чутливості до вірусів Інфекційного ринотрахеїту та діареї. ної ветеринарної медицини (ІЕКВМ) УААН під номером 31 • родина Bovidae, рід Ovis, вид Ovis aries. Штам РО-2/04 має такі властивості: Морфологічні ознаки Клітини мають епітеліоподібну форму з округлими ядрами, що вміщують 2-6 дрібних ядерець різноманітної форми. Цитоплазма клітин гомогенно-дрібнозерниста. Контури між клітинами чіткі, моношар прозорий Каріологічні ознаки Кількість хромосом у клітинах коливається від 56 до 63, модальний клас відповідає 58-60 хромосомам, до яких відноситься 47% клітин популяції Головні зміни в каріотипі клітин РО-2/04 у порівнянні з вихідним каріотипом нирки вівці відбулися за рахунок анеуплоідії та багатокількісних аберацій окремих хромосом, що сталися в процесі адаптування їх до культивування in vitro з використанням нового складу живильного середовища У порівнянні з РО-2 клітини штаму РО-2/04 також відрізняються модальною групою хромосом (більше на 3-4 хромосоми) та більш вираженою гомологією Умови культивування та ростові властивості Середовище культивування: суміш рівних об'ємів середовища 199 та Ігла DMEM з додаванням 10% сироватки крові ВРХ, очищеної поліетиленгликолем Температура культивування 37°С, рН7,2-7,4. Кратність розсіву клітин (1:4)-(1:6), посівна концентрація 80-125тис клітин в 1см3, інтервал пересіву 3-5 діб. На другу добу культивування кількість клітин зростає в 4 рази. Режим кріоконсервування. Суспензію клітин фасують в ампули в концентрації 5-7млн./см3. Як кріозахисне середовище використовують ростове середовище з додаванням 10% стерильного диметил сульфоксид у (ДМСО), (димексиду). Консерву В основу корисної моделі поставлено задачу одержання штаму перещеплюваних клітин нирки вівці РО-2/04, який є стабільним за біотехнологічними характеристиками, що придатний для науково-дослідної роботи і забезпечує високий рівень репродукції вакцинних штамів вірусів інфекційного ринотрахеїту та діареї ВРХ Штам клітин РО-2/04 отриманий з перещеплюваної лінії клітин нирки вівці РО-2, адаптованої до живильного середовища, яке включає рівне співвідношення середовищ Ігла DMEM, 199 та 10% сироватки крові великої рогатої худоби, очищеної поліетиленгликолем, з одночасним добором морфологічно однорідної високочутливих клітин до вірусів інфекційного ринотрахеїту та діареї. Культура витримує більш 200 пасажів без змін морфології клітин та цитогенетичних характеристик. Штам РО-2/04 зберігається в колекції клітинних культур Інституту експериментальної та клініч о со о> 6014 ють в ампулах, що запаяні, охолодженням на першому етапі зі зниженням температури 1°С/хвилину до -30°С, на другому - 10оС/хв. до 70°С, після чого переносять в рідкий азот. Режим відновлення. Ампули з клітинами, які зберігались у рідкому азоті, піддають відтаванню у водяній бані з температурою 39°С. Розморожену клітинну суспензію переносять до стерильного флакону. Подальшу процедуру «відмивання» клітин від кріопротекторів здійснюють шляхом додавання (по краплям) ростового живильного середовища (суміш рівних об'ємів середовища 199 та Ігла DMEM з 10% сироватки крові ВРХ без антибіотиків) до 50-100см3, після чого центрифугують. Визначають концентрацію живих та мертвих клітин в осаду, після чого готують посівну суспензію клітин у ростовому середовищі концентрацією 80-125тис клітин у 1см3 та розливають у культуральні посудини. Через 24 години замінюють живильне середовище на свіже, що сприяє видаленню залишків кріопротектора. Кріоконсервування впродовж 1-3 років не відбивається на зберіганні основних морфологічних, каріологічних характеристиках та вірусрепродуючих властивостях клітин РО-2/04 Контроль штаму РО-2/04 на сторонні контамінанти. При обстеженні клітин РО-2/04 на наявність контамінантів (бактерій, грибів, мікоплазм) отримано негативні результати Комп'ютерна верстка В Мацело Видова ідентичність підтверджена цитогенетичним методом. Приклад використання РО-2/04. Дослідження вірусу діареї та інфекційного ринотрахеїту (Таблиця 1,2). Таблиця 1 Пасажний ріТитри накопичення вакцинного вень культури вірусу інфекційного ринотрахеїту клітин штам "Молдавський" (Ід ТЦД50уСм )• 10 7,0 ЗО 7,0 50 7,0 Таблиця 2 Пасажний рівень культури клітин 10 ЗО 50 Титри накопичення вакцинного вірусу діареї штам "ВК-1" (Ід TI4TW 3 ) 6,0 6,0 6,0 Штам перещеплюваних клітин нирки вівці РО2/04 забезпечує високий рівень репродукції вірусів вірусу діареї" і інфекційного ринотрахеїту та є придатним для науково-дослідної роботи. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601