Спосіб діагностики ураження головного мозку у хворих на гіпертонічну хворобу

Винахід відноситься до медицини, зокрема до досліджень або аналізу матеріалів особливими способами, а саме периферичної крові, та може бути використаний у терапії, кардіології та неврології. Незважаючи на те, що гіпертонічна хвороба (ГХ) є одним з найбільш поширених захворювань у світі [1], а ураження головного мозку є одним із основних її ускладнень [2], на теперішній час не існує достовірних маркерів, які за допомогою лабораторних методів дослідження периферичної крові дозволяють діагностувати ступень ураження головного мозку. Відомий спосіб діагностики ураження головного мозку, що здійснюються шляхом нейровізуалізації (комп'ютерна томографія, магнітно-резонансна томографія головного мозку) є складним, дороговартісним та потребує наявності спеціальної апаратури. Цей метод має показання для дослідження - інсульти, пухлини, гематоми та інші захворювання центральної нервової системи та не застосовуються широко у клінічній практиці для дослідження хворих на гіпертонічну хворобу без наявності інсульту. Він також є не завжди доступним магнітно-резонансна томографія протипоказана хворим з електрокардіостимуляторами, металевими протезами, стемами її тривалість становить від 10 до 20 хвилин, впродовж яких хворий повинен лежати нерухомо, що не завжди можливе. Дослідження за допомогою комп'ютерної томографії пов'язане з високою дозою рентгенівського випромінювання. Дані клінічного дослідження хворого лікарем-невропатологом є інформативними, але не досить об'єктивними. Останнім часом особлива увага приділяється дослідженню ролі молекул клітинної адгезії (VCAM-1, EL AM-1, ILAM-1) у розвитку серцево-судинних захворювань, таких як атеросклероз та ішемічна хвороба серця [3]. Зміна рівня нейрональних молекул клітинної адгезії (NCAM) вивчається при деяких неврологічних та онкологічних захворюваннях - при нервово-психічних розладах, шизофренії, пухлинах [4]. NCAM/CD56 антиген (140кДА) є ізоформою нейрональних молекул клітинної адгезії і експресується на всіх лімфоцитах, здійснюючих нерестриктивний лізис клітин-мішеней [5]. Відомі способи діагностики з визначенням молекулярних маркерів у сиворотці крові не дозволяють безпосередньо діагностувати ураження головного мозку при ГХ. До причин, що перешкоджають використанню методу визначення молекулярних маркерів як критерії ураження головного мозку є те, що вивчається їх зміст безпосередньо у головному мозку або спинномозковій рідині, що є інвазійним втручанням та потребує наявність спеціальних навичок у лікаря. До теперішнього часу не вивчалася зміна рівня нейрональних молекул клітинної адгезії в мембрані лімфоцитів периферичної крові у хворих на ГХ при ураженні головного мозку як органа-мішені. Найбільш близький до винаходу, що заявляється, є спосіб визначення NCAM у клітинах головного мозку при його ураженні (ішемія, нервово-психічні розлади, пухлини). До причин, що перешкоджають досягненню очікуваного технічного результату належать необхідність залучення до діагностики інвазійних методів, таких як пункція головного мозку, або вивчання посмертних зрізів головного мозку, що не може бути використане клініцистом з метою удосконалення лікування хворого. Пункція головного мозку завжди супроводжується високим рівнем травматичності та небезпеки для хворого. В основу винаходу поставлено задачу розробити такий спосіб діагностики ураження головного мозку у хворих на гіпертонічну хворобу, який шляхом проведення малоінвазійного втручання з дослідженням периферичної крові забезпечує атравматичність і проведення оцінки на ранньому етапі захворювання при використанні. Вищезазначений технічний результат при здійсненні винаходу досягається тим, що у відомому способі діагностики рівня нейрональних молекул клітинної адгезії (NCAM/CD56) в головному мозку та аналіз отриманого показника, який відрізняється тим, що як біологічне вміст глікопротеїну нейрональних молекул клітинної адгезії визначають шляхом імуноблотінгу і встановлюють ураження головного мозку, якщо концентрація останнього в мембрані лімфоцитів перевищує нормативні показники більш ніж у 2 рази. Спосіб діагностики ураження головного мозку у хвори х на гіпертонічну хворобу полягає в тому, що у хворих на гіпертонічну хворобу визначається вміст NCAM/CD56 у мембранній фракції лімфоцитів венозної крові методом імуноблотінгу, як найбільш чутливого та адекватного методу для визначення антигенів (поліпептидного складу) з використанням кролячої антисиворотки проти NCAM/CD56 ("Sigma"). Лімфоцити виділяються із суспензії клітин після центрифугування у градієнті щільності верографін-фікол. Для солюбізації мембранних білків отриманий осадок ресуспендують у 0,4мл того ж буферу, котрий додатково містить 2% Тритон Х-100, ефективно екстрагуючий мембранні білки. Після 30 хвилин екстракції повторно центрифугують при тих же умовах. Електрофорез проводять у градієнті поліакріламіду 7,5-17,5% у присутності 0,1% додецилсульфату натрію по Laemmli [6]. Визначення поліпептидного складу ізоформ NCAM проводиться методом імуноблотінгу з застосуванням моноспецифічної сиворотки, як описано раніше [3]. Вміст загального білку в екстрактах визначали методом Лоурі в модифікації Міллера [7]. Відносну інтенсивність поліпептидних зон оцінюють за допомогою комп'ютерної обробки отриманих сканованих результатів імуноблотінгу. Виявляється достовірне підвищення вмісту NCAM/CD56 у хворих на гіпертонічну хворобу з ураженням головного мозку у вигляді дисциркуляторної гіпертензивної енцефалопатії та/або інсульту в порівнянні з хворими без такого ураження, що було підтверджено за допомогою магнітно-резонансної томографії головного мозку. Запропонована можливість рішення задачі, таким чином, дозволяє використовуючи сучасні біохімічні методики, діагностува ти ураження головного мозку ще на ранніх етапах розвитку захворювання та здійснення цілеспрямованої профілактики цереброваскулярних катастроф. Спосіб є доступним, тому що визначення рівня NCAM/CD56 у хворих здійснюється у лімфоцитах периферичної венозної крові і не потребує складних втр учань (люмбальна пункція з забором спинномозкової рідини) або посмертного вивчення зрізів мозку. Це пов'язане з тим, що вивчається ізоформа NCAM-CD56, яка є мембранним глікопротеїном лімфоцитів. Запропонований спосіб не має протипоказань, є безпечним та може використовува тися у всіх пацієнтів. Для діагностики ураження головного мозку у хворих на гіпертонічну хворобу необхідно здійснити забір венозної крові для подальшого визначення вмісту NCAM/CD56 у мембранній фракції лімфоцитів методом імуноблотінгу з використанням кролячої антисиворотки проти NCAM/CD56 (фірми "Sigma"). Додатково досліджують концентрацію лімфоцитів в крові здорових донорів. Лімфоцити виділяються із суспензії клітин після центрифугування у градієнті щільності верографін-фікол. Суспензія лімфоцитів (0,1г) гомогенізується при температурі 4°С в 2,0мл 0,025М тріс-буфера (рН8,0), який містить 2мМ ЕДТА, 1мМ 2-меркаптоетанол, 0,1мМ фенілметілсульфонілфторид та соєвий інгібітор трипсину (10кг/мл). Гомогенат центрифугують при 60000g на протязі 60 хвилин. Супернатант (S1) містить розчинні білки. Для солюбізації мембранних білків отриманий осадок ресуспендують у 0,4мл того ж буферу, котрий додатково місіть 2% Тритон Х-100, ефективно екстрагуючий мембранні білки. Після 30 хвилин екстракції повторно центрифугують при тих же умовах. Електрофорез проводять у градієнті поліакриламіду 7,5-17,5% у присутності 0,1% додецилсульфату натрію по Laemmli. Визначення поліпептидного складу ізоформ NCAM проводиться методом імуноблотінгу з застосуванням моноспецифічної сиворотки, як описано раніше. Вміст загального білку в екстрактах визначали методом Лоурі в модифікації Міллера. Відносну інтенсивність поліпептидних зон оцінюють за допомогою комп'ютерної обробки отриманих сканованих результатів імуноблотінгу. Приклад 1. Хворий P., 60 років, потрапив у лікарню зі скаргами на головний біль у потиличній ділянці, задишку при значному фізичному навантаженні, слабкість, порушення пам'яті. З анамнезу відомо, що від страдає на ГХ близько 10 років. При клінічному дослідженні набряків немає, дихання везикулярне, хрипів немає, виявлено зміщення лівої межі відносно серцевої тупості вліво на 1см, цифри AT 155/95. У хворого при консультації невропатолога діагностована дисциркуляторна гіпертензивна енцефалопатія І стадії з астено-невротичним синдромом. На очному дні виявлена гіпертонічна ангіопатія судин сітківки. При магнітно-резонансному (МР) дослідженні знайдено розширення бічних шлуночків, біля них нечітке підвищення сигналу у режимі Т2, у напівовальному центрі - нечітке вогнище підвищеного в Т2 сигналу розмірі 1см - МР-картини дисциркуляторної енцефалопатії. Встановлено діагноз: ГХ II стадії, гіпертензивна дисциркуляторна енцефалопатія І стадії. У цього хворого відмічався підвищений вміст NCAM/CD56 - 123од.опт. щільності, що більш ніж у 2 рази перевищувало рівень NCAM/CD56 у здорових обслідуваних. Приклад 2. Хворий П., 61 рік, поступив у лікарню зі скаргами на здавлюючи болі за грудиною, серцебиття страдає на ГХ близько 7 років. Набряків немає, ліва межа відносної серцевої тупості зміщена вліво на 1см, цифри AT140/90, ангіопатія судин сітківки. При магнітно-резонансній томографії патологічних змін з боку головного мозку на знайдено. Діагноз: ГХ II стадії. ІХС: стенокардія напруги, II функціональний клас. Вміст NCAM/CD56 складав 64од.опт. щільності, що незначно перевищує рівень у здорових осіб. Приклад 3. Хворий У., 65 років, скаржиться на головні болі, запаморочення, шум у вуха х, погіршення нам'яти. Страдає на ГХ близько 12 років. Рік тому переніс ішемічний інсульт. Набряків немає, ліва межа відносної серцевої тупості зміщена вліво на 1см, цифри AT150/90, ангіопатія судин сітківки. Діагноз: ГХ III стадії. Залишкові явища гострого порушення мозкового кровообігу (ішемічний інсульт в басейні середньої мозкової артерії). Вміст NCAM/CD56 складав 115од.опт. щільності. Приклад 4. Хворий С., 50 років, скаржиться на загрудинні болі при навантаженні, головні болі. У 94 році переніс інфаркт міокарду. ГХ близько 13 років. Набряків немає, ліва межа відносної серцевої тупості зміщена вліво на 1см, цифри AT150/95, ангіопатія судин сітківки. Діагноз: ГХ II стадії. ІХС: стенокардія напруги II функціональний клас. Постінфарктний кардіосклероз (1994p.). Вміст NCAM/CD56 складав 56од.опт. щільності. Приведені приклади дозволяють ствердити, що рівень NCAM/CD56 відповідає ступеню ураження головного мозку у хворих на різних стадіях гіпертонічної хвороби. Рівень NCAM/CD56 найбільший у хворих на ГХ II стадії при гіпертонічній дисциркуляторній енцефалопатії, ще до розвитку інсульту, дещо менший у хворих з перенесеним інсультом, що суттєво відрізняється від показників у хворих на ГХ та не маючи ураження головного мозку - з ішемічною хворобою серця: стенокардією і/або інфарктом міокарду. Показники рівня NCAM/CD56 у всі х хворих на ГХ вищі ніж у здорових обслідуваних, причому рівень значно (у 1,5-2,5 рази) збільшується при наявності ураження головного мозку. Таким чином, розроблений винахід відповідає умовам "промислова придатність", "новизна", "винахідницький рівень" і може бути кваліфікований винаходом України. Джерела інформації. 1. Kaplan N.M. Clinical hypertension. - 7th ed. Baltimore: Williams & Wilkins. 1998. - 638p. 2. Mac Mahon S., Peto R., Culter J. et al. Blood pressure, stroke and coronary heart disease // Lancet. - 1990. Vol.335. - P.765-774. 3. Berezin, V., Bock, E. and Poulsen, F.M. The neural cell adhesion molecule. // Current Opinion in Drug Discovery&Development, 2000, 3:605-609. 4. Шепелева И.И., Чехонин В.П. Нейрональные молекулы клеточной адгезии (структура, функции, клиникодиагностические перспективы). // Журнал невропатологии и психиатрии им. Корсакова. - 1996. - №5. - С. 113-117. 5. Lanier L.I., Chang С., Azuma M. Molecular and functional analysis of human natural killer cell-associated neural cell adhesion molecule (N-CAM/CD56). // J. Immunol. - 1991. - 146:4421-4426. 6. Laemmli O.H. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. - V.227, N1. - P.243 - 246. 7. Miller G.L. Protein determination for large numbers of samples // Anal. Chem. - 1959. - V.31, N5. - P.964-966.