Спосіб лікування злоякісних пухлин комбінацією немодифікованих фулеренів с60 і доксорубіцину

Реферат: Спосіб лікування злоякісних пухлин немодифікованими фулеренами С 60 у комбінованій хіміотерапії з протипухлинним препаратом доксорубіцином, що сприяє гальмуванню як росту пухлини, так і метастазів, а також зменшує його токсичний вплив на організм. UA 102139 C2 (12) UA 102139 C2 UA 102139 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід, що заявляється, належить до галузі експериментальної онкології і може використовуватися як спосіб підвищення протипухлинної активності немодифікованих фулеренів С60 у комбінованій хіміотерапії з доксорубіцином. Відомо, що біологічно активні водорозчинні фулерени С 60 є нетоксичними сполуками [1-2] проявляють мембранотропні [3-4] та антиоксидантні властивості [5] і, таким чином, слугують основою для створення нового класу перспективних лікарських препаратів протипухлинної дії [6]. Так, у роботі [7] вивчена дія амінокислотних похідних фулерену С 60 (АПФ) у комбінації з протипухлинним препаратом адріаміцином (АДР) як модифікаторів біологічних реакцій у терапії метастазуючих пухлин. Антиметастатичну активність АПФ у комбінації з АДР досліджували на моделі метастазуючої пухлини - карциноми Льюїс (рак легень) у мишей лінії BDF1. Протипухлинний ефект оцінювали за індексом інгібування метастазів (ІІМ, %). Було виявлено, що АПФ проникають через ліпідний бішар біологічної мембрани і є ефективними інгібіторами перекісного окиснення ліпідів. Максимальний терапевтичний ефект застосування АПФ (доза 50 мг/кг) у комбінації з АДР (доза 1 мг/кг) становив 40 % ІІМ. Автори роботи [8] в рамках хімічноіндукованої моделі раку молочної залози досліджували можливу захисну роль фулеренолу (С60(ОН)24) щодо дії протипухлинного препарату доксорубіцину, який викликав легеневу токсичність у щурів. Отримані результати чітко показують, що застосування лише доксорубіцину (доза 8 мг/кг) помітно погіршує функцію легенів, однак попереднє введення фулеренолу (доза 100 мг/кг) за 30 хв до доксорубіцину запобігає його токсичній дії внаслідок інгібування окисного стресу. Але при цьому недоліками вказаних аналогів [7-8] при подальшому використанні фулеренових наноструктур у клінічній онкології є, з одного боку, складність хімічної модифікації фулеренів С60 з подальшим формуванням їх водних розчинів для цілеспрямованого транспортування у клітинне середовище, а, з іншого боку, виникає ризик зростання їх токсичної дії щодо нормальних клітин. Прототипом до запропонованого способу є спосіб лікування злоякісних новоутворень комбінацією С60 фулереновмісного нанокомпозиту і циклофосфаміду [6]. В основу винаходу поставлена задача створити спосіб використання фулеренів С 60 в експериментальній онкології, які б у комбінованій хіміотерапії з відомими протипухлинними препаратами без застосування зовнішніх чинників, зокрема опромінення, підвищували в цілому протипухлинну активність. Поставлена задача вирішується тим, що в способі застосування фулеренів С 60 у терапії злоякісних новоутворень використовують немодифіковані (чисті), водорозчинні і нецитотоксичні фулерени С60, які, згідно з винаходом, за підібраних низьких терапевтичних доз і технології введення в живий організм у комбінованій хіміотерапії з доксорубіцином, здатні як проявляти високу протипухлинну активність, так і запобігати його токсичній дії на організм. Суть винаходу пояснюється таким прикладом. Приклад. Водні розчини немодифікованих фулеренів С 60 (чистота 99,5 %) були отримані за методикою [9]. Концентрація фулеренів С60 у водному розчині складала 1,0 мг/мл. Скануюча тунельна мікроскопія виявила у водному розчині розподіл як незначної кількості фулеренових кластерів розміром до ~2.8 нм, так і поодиноких фулеренів С60 (діаметр ~0.7 нм). Миші чоловічої статі лінії С57В1/6J вагою 20-21 г утримували у віварії на стандартному харчовому раціоні. Середня температура у віварії дорівнювала 25±1 °C. Досліди з тваринами проводили з дотриманням етичних норм, затверджених Європейською комісію з утримання тварин. Перещеплення пухлини - карциноми легень Льюіс, проводили в подушечку кінцівки тварин 6 (вихідна кількість пухлинних клітин складала ~1·10 ; антиметастатичний ефект; Експеримент 1) 5 або внутрішньом'язово у кінцівку тварини (вихідна кількість пухлинних клітин складала ~5·10 ; протипухлинний ефект; Експеримент 2). Як відомо, штам цієї пухлини характеризується високим ступенем ураження легень метастазами. Ефективність застосованої протипухлинної технології оцінювали за такими кількісними показниками: A  B  A i  Bi - індекс інгібування метастазів: k IIM  0 0  100 % , де А0 і Aі - частота i A 0  B0 метастазування у групі 0 (контроль) і піддослідній групі і, відповідно; В0 і Ві - середня кількість метастазів у певному органі тварин групи 0 (контроль) і піддослідної групи і, відповідно; 1 UA 102139 C2 - гальмування росту пухлини: k ГРП  V0  Vi  100 % , де V0 і Vі - середнє значення об'єму i V0 пухлини у тварин групи 0 (контроль) і піддослідної групи і, відповідно; V a  b3 , де а і b - довжина і ширина (мм) пухлинного вузла; 16 ti  t0  100 % , де t0 і tі - середня тривалість t0 життя тварин (діб) у групі 0 (контроль) і піддослідній групі і, відповідно; - виживаність тварин у піддослідній групі і порівняно з контролем ( k B , %). i Статистичну обробку отриманих результатів проводили з використанням пакету програми STATISTICА з урахуванням обчислювальних методик [10]. Протипухлинний препарат доксорубіцин ("Ebewe", Австрія; вихідна концентрація 0,1 мг/мл) вводили внутрішньочеревно піддослідним тваринам з перещепленою пухлиною в об'ємі 0,1 мл (доза 0,5 мг/кг) один раз на 5 днів (усього 2 (Експеримент 1) і 4 (Експеримент 2) рази) з урахуванням того факту, що доксорубіцин виводиться з організму із сечею протягом 5-ти днів. Водні розчини немодифікованих фулеренів С60 (вихідна концентрація 1,0 мг/мл) вводили внутрішньочеревно піддослідним тваринам з перещепленою пухлиною в об'ємі 0,1 мл (доза 5 мг/кг) один раз на 5 днів (усього 4 рази) за 30 хв до введення доксорубіцину. При цьому враховували той факт, що введені внутрішньочеревно щурам фулерени С 60 (доза 500 мг/кг) виводяться з організму протягом 2-4 днів [11]. Введення доксорубіцину та фулеренів С60 у комбінації з доксорубіцином починали на 10-й день після початку перещеплення пухлини, коли вона з'являлася візуально. Нарешті, групу тварин без введення доксорубіцину чи фулеренів С60+доксорубіцин, але з перещепленою пухлиною використовували як контроль. Початкова кількість тварин у кожній піддослідній групі складала 7. В Експерименті 1 (антиметастатичний ефект) на 20-й день після перещеплення пухлини усі піддослідні тварини були умертвлені з метою підрахунку кількості метастазів в легенях кожної тварини. Результати Експерименту І (антиметастатичний ефект) представлені в Табл. 1. Як бачимо, індекс інгібування метастазів для групи 1 (введення доксорубіцину) незначно перевищує (в ~1,19 рази) цей показник для групи 2 (введення фулеренів С 60+доксорубіцин) на 20-й день після перещеплення пухлини. Результати Експерименту 2 (протипухлинний ефект) представлені в Табл. 2. Протипухлинний ефект препаратів почали реєструвати на 10-й день (21.06.2011) після перещеплення пухлини (11.06) для піддослідної групи 1 (введення доксорубіцину) та групи 2 (введення фулеренів С60+доксорубіцин). Гальмування росту пухлини в групі 1 досягало максимуму 28 % на 14-й день після перещеплення пухлини, а потім взагалі припинялося. Гальмування росту пухлини в групі 2 зменшувалося від максимальної величини 34 % (10-й та 14-й день) до значення 21 % (21-й день після перещеплення пухлини). Остання тварина у контрольній групі 0 загинула на 29-й день (10,06) від початку експерименту. Виживаність тварин у групі 2 (57,1 %) у двічі перевищила цей показник для групи 1 (28,6 %). Нарешті, зростання тривалості життя тварин у групі 1 складало 15,0 %, у той час як для групи 2 воно досягало 24,4 %. Фіг. 1 демонструє характерну динаміку пухлинного росту у тварин піддослідної групи 0 (контроль; Фіг. 1, а), групи 1 (введення доксорубіцину; Фіг. 1, б) та групи 2 (введення фулеренів С60+доксорубіцин; Фіг. 1, в) в Експерименті 2 на 20-й день після перещеплення пухлини. Розрахунки показують, що середній об'єм пухлини у контролі перевищує цей параметр у піддослідних групах 1 і 2 в ~3 і ~4.5 рази, відповідно. Важливо зазначити, що візуальні спостереження за піддослідними тваринами показали, що тварини групи 2 (введення фулеренів С60+доксорубіцин) у порівняні з тваринами контрольної групи 0 і групи 1 (введення доксорубіцину) проявляли більш високу рухливість, колір їхньої шерсті мав більш яскраво-виражений відтінок. Нарешті, тривалість життя останньої піддослідної тварини з групи 2 (42 дні) перевищила цей параметр для останньої тварини з групи 1 (37 днів) та контрольної групи 0 (29 днів) в 1,14 та 1,45 рази, відповідно. Отже, введення водорозчинних нетоксичних немодифікованих фулеренів С60 за низької терапевтичної дози 5 мг/кг у комбінації з доксорубіцином (доза 0,5 мг/кг) підвищує протипухлинну активність, а саме сприяє вірогідному гальмуванню як росту пухлини, так і метастазів карциноми легені Льюїс у мишей чоловічої статі лінії C57B1/6J: максимальний терапевтичний ефект досягав 34 % за гальмуванням росту пухлини та 79 % за індексом інгібування метастазів; виживаність тварин складала 57,1 % порівняно з контролем; зростання - зростання тривалості життя тварин: k iЗТЖ  5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 2 UA 102139 C2 тривалості життя тварин досягало 24,4 %. З іншого боку, отримані результати свідчать, що введення фулеренів С60 у комбінації з доксорубіцином цілеспрямовано запобігає його токсичній дії на організм, в першу чергу кардіотоксичному ефекту. Таблиця 1 Експеримент 1 (антиметастатичний ефект): початок перещеплення пухлини - 20.05.2011. Введення доксорубіцину (група 1) та фулеренів С60+доксорубіцин (група 2) після перещеплення пухлини - 30.05 і 04.06.2011. Початкова кількість тварин у кожній піддослідній групі складала n=7 Номер піддослідної групи тварин, i 1 2 Індекс інгібування метастазів, k IIM , %* i 94 79 * відмінності достовірні у порівнянні з контролем (р