Спосіб визначення гормонів похідних індолу та їх метаболітів в одній пробі біологічного матеріалу

Спосіб визначення гормонів похідних індолу та їх метаболітів в одній пробі біологічного матеріалу шляхом проведення хроматографічного дослідження, який відрізняється тим, що викори стовують висхідну тонкошарову хроматографію на силуфолових платівках з підбором системи (ізопропанол, аміак, вода) та додатково здійснюють спектрофотометричне кількісне визначення похідних індолу та їх метаболітів за формулою D0C0N С= Винахід стосується медицини, а саме, нормальної фізіологи, і може бути використаний в КЛІНІЧНІЙ лабораторній діагностиці Існує декілька способів визначення речовин похідних індолу, але вони не дозволяють здійснити диференційний ПІДХІД до визначення всіх цих речовин в одній біологічній пробі Відомий спосіб визначення гормону похідних індолу мелатоншу, який полягає у флюориметричному визначенні мелатоншу крові (Дадамбаев ЕТ Флюориметрический метод определения мелатонина крови //Лабораторное дело -1986 -№1 -С 3032) Спільною суттєвою ознакою аналога і винаходу, що заявляється, є така - визначення мелатоншу Цей спосіб є недостатньо ефективним, тому що дозволяє визначати в одній пробі біологічного матеріалу лише мелатонш без визначення його метаболітів Найбільш близьким за технічною сутністю та результатом, що досягається, є спосіб, який полягає у хроматографічному визначенні триптофану та мелатоншу (Opienska-Klaut S , Kraczkowski M The methods of melatonm definition // J Chromatogr 1985-Vol-17-P 228) Спільними суттєвими ознаками прототипу і винахіду, що заявляється є такі - визначення гормонів похідних індолу та їх метаболітів - застосування хроматографічного методу дослідження Цей епосі є недостатньо ефективним, тому що не дозволяє диференційно розділити та визначіти гормони ПОХІДНІ індолу та їх метаболіти в одній пробі біологічного матеріалу В основу винаходу поставлено задачу удосконалення способу визначення гормонів похідних індолу та їх метаболітів в одній пробі біологічного матеріалу шляхом пібору системи (ізопропанол, аміак, вода) для хроматографії та методу визхідноі тонкослойної хроматографії на силуфолових платівках з застосуванням спектрофотометрії та математичних розрахунків, що дозволяє більш диференційовано розділити ПОХІДНІ індолу в біологічному матеріалі Поставлена задача вирішується тим, що у способі, який включає хроматографічне визначення гормонів похідних індолу та їх метаболітів, новим є те, що використовують нову систему (ізопропанол, аміак, вода) для визхідної тонкослойної хроматографії на силуфолових платівках з подальшим спектрофотометричним КІЛЬКІСНИМ визначенням похідних індолу за формулою Dea де Do - оптична густина стандартного зразка, Co - концентрація стандартного зразка, De - оптична густина експериментального зразка, N - розведення, а - об'єм біологічного матеріалу D0C0N п о DDa Do - оптична густина стандартного зразка, Co - концентрація стандартного зразка, De - оптична густина експериментального зраС= (О ю 51446 зка, N - розведення а - об'єм біологічного матеріалу Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, татехничним результатом полягає у такому Підбір нової системи для визхідної тонкослойноі хроматографії на силуфолових платівках дозволить розділити ПОХІДНІ індолу в біологічному матеріалі Використання спектрофотометричного методу дослідження з подальшими математичними розрахунками за формулою дозволить з більшою точністю визначити КІЛЬКІСТЬ кожного з похідних індолу в біологічному матеріалі Таким чином, сукупність вищезазначених позитивних впливів дозволить більш диференційно розділити ПОХІДНІ індолу в одній пробі біологічного матеріалу та підвищити точність їх КІЛЬКІСНОГО визначення Спосіб здійснюють таким чином До 0,5мл сироватки крові, сечі або гомогенату додають 5,0мл етанолу та екстрагують 20хв при температурі 20°С Після центрифугують 20хв при 2500об\хв Одержаний екстракт випарюють на водяній бані до 0,2мл Після чого 0,2мл цього екстракту наносять на ЛІНІЮ старту пластини "Силуфол -UV254", яку поміщують до хроматографічної камери, яка містить суміш ізопропанол 25% аміак вода (20 1 2) та хроматографують протягом 20хв Пластину сушать та проявляють в УФ -СВІТЛІ ЗОНИ адсорбції мелатоншу, серотоніну, триптофану та їх метаболітів ідентичні зонам адсорбції стандартів Значення RF мелатоншу, серотоніну, триптофану та їх метаболітів приведені у таблиці Таблиця Речовина триптофан серотонін мелатонін 3-індолуксусна кислота 5-оксишдолуксусна кислота 3-індолілпропюнова кислота С= зка, DQCQN DDa Do - оптична густина стандартного зразка, Co - концентрація стандартного зразка, De - оптична густина експериментального зра N - розведення а - об'єм біологічного матеріалу Приклад У білого щура масою 200г з брюшної аорти береться 2мл крові, додається гепарин (9 1) та центрифугується Юхв при 1500об/хв ВІДДІЛЯ ЮТЬ сироватку До 0,5мл сироватки крові, сечі або гомогенату додають 5,0мл етанолу та екстрагують 20хв при температурі 20°С Після центрифугують 20хв при 2500об\хв Одержаний екстракт випарюють на водяній бані до 0,2мл Після чого 0,2мл цього екстракту наносять на ЛІНІЮ старту пластини " Силуфол -UV254", яку поміщують до хроматографічної камери, яка містить суміш ізопропанол 25% аміак вода (20 1 2) та хроматографують протягом 20хв Пластину сушать та проявляють в У Ф -СВІТЛІ ЗОНИ адсорбції мелатоншу, серотоніну, триптофану та їх метаболітів ідентичні зонам адсорбції стандартів Значення RF мелатоншу, серотоніну, триптофану та їх метаболітів приведені у таблиці Таблиця Речовина триптофан серотонін мелатонін 3-шдолуксусна кислота 5-оксишдолуксусна кислота 3-шдошлпропіонова кислота RF 11 23 8 26 18 31 Далі пластину оприскують 3% розчином алоксану у діметілформаміді та проявляють при температурі 100°С Концентрацію досліджуємих речовин виявляють спектрофотометрично при А = 470нм Концентрацію розраховують за формулою RF 11 23 8 26 18 31 с= Далі пластину оприскують 3% розчином алоксану у діметілформаміді та проявляють при температурі 100°С Концентрацію досліджуємих речовин виявляють, спектрофотометричне при Л= 470нм Концентрацію розраховують за формулою де DDa Do - оптична густина стандартного зразка, Go - концентрація стандартного зразка, De - оптична густина експериментального зразка, N - розведення а - об'єм біологічного матеріалу ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71