Спосіб виявлення структур клітин у біологічному матеріалі

Винахід відноситься до галузі медицини, а саме до фізіології та клінічної медицини. Відомий спосіб виявлення структур клітин, шляхом визначення a - нафтілацетатестерази (Справочник по клиническим и лабораторным методам исследования /Под ред. Е.А. Кост. - М.:Медицина, 1975, С.177-178.), який складається з взяття крові, приготування мазків, фіксації в парах формаліну, промивання в дистильованій воді, поміщення мазків в інкубаційний розчин a - нафтілацетату у фосфатному буфері, промивання в боратному буфері, промивання в дистильованій воді протягом 2-3хв., фарбування в кислому гемалоуоні, промивання в дистильованій воді протягом 15хв., висушування, мікроскопічного дослідження. Ознаки, спільні з ознаками заявленого способу: взяття біологічного матеріалу, приготування препаратів, фіксація в парах формаліну, поміщення в інкубаційний розчин, до складу якого входить a - нафтілацетат та фосфа тний буфер, промивання в боратному буфері, дворазове промивання в дистильованій воді, фарбування, мікроскопічне дослідження. Недоліки: спосіб не дозволяє виявляти нуклеоли в лімфоцитах та моноцитах, хромоцентри в лейкоцитах. Відомий спосіб виявлення структур клітин, шляхом визначення нуклеол у лімфоцитах (Г.И. Козинец, В.М. Погорелов, Д.А. Шмаров, и др. Клетки крови - современные технологии их анализа. - М.:Триада-фарм, 2002, С.476-477), який включає взяття крові, приготування мазків, фіксацію в парах формаліну протягом 5-15хв., фарбування в буферному розчині метилового синього, висушування, мікроскопічне дослідження. Ознаками, спільними з ознаками заявленого способу, є: взяття біологічного матеріалу, приготування препаратів, фіксація в парах формаліну, фарбування в буферному розчині метилового синього, висушування, мікроскопічне дослідження. Недоліками методу є відсутність виявлення a - нафтілацетатестерази в Тлімфоцитах, моноцитах, тромбоцитах. В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб виявлення структур клітин у біологічному матеріалі, який шляхом фарбування нуклеол, хромоцентрів та a - нафтілацетатестерази дозволяє проводити їх оцінку, і за рахунок цього підвищити точність, скоротити час та собівартість дослідження. Суттєвими ознаками винаходу є: взяття біологічного матеріалу, приготування мазків або зліпків, фіксація в парах формаліну від 30хв. до 3 діб, поміщення в інкубаційний розчин 10мг a - нафтілацетату, розчиненого у 0,2мл хімічно чистого ацетону, з додаванням 40мол 0,1М фосфатного буфера (рН7,8-7,9), 0,8мол 4%-ного бездіазотованого парарозоаніліну і 0,8мол 4%-ного нітриту натрію на 30-60хв. при 22-37°С, промивка в дистильованій воді 1-5хв., повторна фіксація в парах формаліну протягом 15-30хв., поміщення у 0,05% водяний розчин метиленового синього при температурі 70-75°С на 5-30хв., поміщення у цитратний буфер рН4,8-5,0 на 1-3хв., промивка у 2 порціях дистильованої води по 1-5хв. в кожній, висушування, мікроскопічне дослідження. Відмінними ознаками є: час першої фіксації, поміщення в інкубаційний розчин 10мг a - нафтілацетату, розчиненого у 0,2мл хімічно чистого ацетону, із додаванням 40мол 0,1М фосфатного буфера (рН7,8-7,9), 0,8мол 4%-ного бездіазотованого парарозоаніліну і 0,8мол 4%-ного нітриту натрію на 30-60хв. при 22-37°С, промивка в дистильованій воді 1-5хв., повторна фіксація в парах формаліну 15-30хв., поміщення у 0,05% водяний розчин метиленового синього при температурі 70-75°С на 5-30хв., поміщення у цитратний буфер рН4,8-5,0 на 1-3хв., промивка у 2 порціях дистильованої води по 1-5хв. у кожній. Спосіб здійснюють таким чином: беруть біологічний матеріал та готують мазки або зліпки. Свіжоприготовані мазки крові, що зберігалися не більше 2 днів з моменту взяття, фіксують у парах нейтрального формаліну від 30хв. до 3-х днів. Після закінчення часу фіксації мазки або зліпки виймають і ставлять на підставки чи розкладають на рівну поверхню мазками вгору для вивітрювання парів формаліну протягом 30-60хв. Потім занурюють мазки або зліпки в інкубаційне середовище на 30-60хв. при 22-37°С. Готування інкубаційного середовища: інкубаційне середовище готують змішуванням 10мг a - нафтілацетату, розчиненого у 0,2мл хімічно чистого ацетону, із додаванням 40мол 0,1М фосфа тного буфера (рН7,8-7,9), суміш перемішують до розчинення. Потім додають 0,8мол 4%-ного бездіазотованого парарозоаніліну і 0,8мол 4%-ного нітриту натрію. Фільтрують. Після закінчення часу інкубації мазки або зліпки промивають у дистильованій воді 1-5хв. Потім висушують. Мазки або зліпки повторно фіксують у парах формаліну протягом 15-30хв. Після фіксації мазки або зліпки поміщують у 0,05% водяний розчин метиленового синього при температурі 70-75°С на 5-30хв. Після закінчення цього часу мазки або зліпки поміщують у цитратний буфер рН4,8-5,0 на 1-5хв. Після цього промивають мазки або зліпки в 2 порціях дистильованої води по 1-5хв. у кожній. Потім висушують мазки або зліпки і проводять мікроскопічне дослідження. Нуклеоли лімфоцитів і моноцитів чітко виявляються на тлі світлого ядерного хроматину у вигляді темносиніх ділянок. Хромоцентри виявляються у ви гляді темно-синіх ділянок у клітинах лейкоцитарного ряду. Локалізація a - нафтілацетатестерази виявляється у вигляді дрібної рясної червоної зернистості в моноцитах. У Т-лімфоцитах виявляється активність a - нафтілацетатестерази у вигляді великих одиничних червоних гранул. У тромбоцитах активність ферменту виявляється у вигляді дрібної червоної зернистості. Порівняльний аналіз заявленого способу і відомого показує, що заявлений спосіб відрізняється можливістю одночасної оцінки декількох параметрів, зменшення часу і собівартості фарбування мазків або зліпків біологічного матеріалу. Спосіб, що заявляється, може бути використаний для диференціювання Т- і В-лімфоцитів та їхніх попередників і їхньої активності при патологічних станах, для ди ференціювання моноцитів і їхніх попередників, та їхньої активності; в лейкоцитарному паростку методика дає можливість визначення кількості і морфології хромоцентрів, у тромбоцитарному паростку можлива оцінка ступеня активації тромбоцитів (макроформи, клітки роздратування) і диференціювання їх за формою. У сукупності спосіб дає можливість повноцінної оцінки лейкоцитарного та тромбоцитарного ростка в нормі та патології. Приклад конкретного виконання: Брали кров з пальця людини та готували мазки. Свіжоприготовані мазки крові зафіксували в парах формаліну протягом 30хв. та витримали при кімнатній температурі до зникнення запаху формаліну. Потім занурювали мазки в інкубаційне середовище на 1 годину при 22°С. Інкубаційне середовище готували таким чином: Інкубаційне середовище готували змішуванням 10мг a - нафтілацетату, розчиненого у 0,2мл хімічно чистого ацетону, із додаванням 40мол 0,1М фосфатного буфера (рН7,8-7,9), перемішували до розчинення. Потім додавали 0,8мол 4%-ного бездіазотованого парарозоаніліну і 0,8мол 4%-ного нітриту натрію на 30-60хв. при 22-37°С. Фільтрували. Після закінчення часу інкубації мазки промивали в дистильованій воді 1хв. Потім висушували. Мазки повторно фіксували у парах формаліну протягом 15хв. Після фіксації мазки поміщували у 0,05% водяний розчин метиленового синього при температурі 70-75°С на 10хв. Після закінчення часу фарбування мазки поміщували в цитратний буфер рН4,8-5,0 на 1хв. Після цього промивали мазки в 2 порціях дистильованої води по 1хв. в кожній. Потім висушували мазки і проводили мікроскопічне дослідження. Виявлено: 94% лімфоцитів з неактивованими нуклеолами, 5% з активованими нуклеолами, 1% з ознаками баластної трансформації. 32% нейтрофилів з хромоцентрами, 68% нейтрофилів без хромоцентрів. 78% В-лімфоцитів, 12% Т-лімфоцитів. 12% активованих тромбоцитів роздратування (що містять велику кількість a - нафтілацетатестерази), 88% інших типів тромбоцитів. Дані дозволили зробити висновок про проведення терапії. Таким чином, запропоноване рішення дозволяє при проведенні одного дослідження здійснити комплексну оцінку нуклеол, хромоцентрів, a - нафтілацетатестерази в біологічному матеріалі, що дозволяє знизити похибку і тим самим підвищити якість дослідження. Рішення відповідає всім критеріям запропонованого винаходу.