Спосіб отримання гіперімунного гаммаглобулінового препарату проти torcн-інфекцій

Спосіб отримання пперімунного гаммаглобулінового препарату проти TORCH-шфекцій шля Винахід відноситься до галузі медицини, зокрема до фармакологи, препаратів імуномодулюючоі дії, і може бути використаний для імунотерапії та імунопрофілактики вірусних та протозойних захворювань, а саме захворювань, викликаних TORCH-шфекціями Актуальність винаходу обумовлюється різким збільшенням на СЬОГОДНІШНІЙ день числа захворювань, які викликаються TORCH-шфекціями, що значною мірою пов'язане з погіршенням екологічної ситуації, а також широким використанням імунодепресивної терапії TORCH-інфекцм є однією з основних причин вторинного безпліддя у жінок репродуктивного віку, що приводить до "звичного" викидня, "замершої" вагітності, мертвонародженню Активація TORCH-шфекцій під час вагітності може призводити до формування тяжких вад розвитку плоду, інколи несумісних з життям, або внутрішньоутробного інфікування плоду, яке може проявлятися в різні періоди життя дитини У дорослих основні інфекції TORCH-групи (цитомегаловірус - CMV, вірус простого герпесу - HSV 1/2, вірус оперезуючого герпесу - HZV, Епштейна-Барра вірус - EBV, токсоплазмоз) найбільш часто викликають ураження нервової системи, очей, імунної системи На цей час широко ВІДОМІ імунні гамма-глобуліни, вилучені з суміші плазм крові різних донорів, які латентно або активно перенесли в минулому різноманітні інфекції, а також способи, що дозволяють одержувати ці імунні гамма-глобуліни Гамма-глобулін, одержаний таким чином, може Зоя хом спиртової обробки фракцій плазми крові невакцинованих донорів з високим вмістом антитіл до однієї з інфекцій етиловим спиртом з подальшим центрифугуванням і відокремленням цільового продукту, який відрізняється тим, що використовують фракцію II + III, а на етапі відокремлення протромбіну рН встановлюють на рівні 5,0, а на заключному етапі виділення осаду гаммаглобуліну рН встановлюють рівним 7,2, після чого суміш піддають центрифугуванню спочатку при 1,5 тис об /хв протягом ЗО хв , а потім при 3,0 тис об /хв протягом 45 хв містити широкий спектр антитіл до різних мікробних та вірусних антигенів Проте різні сери гаммаглобуліну, звичайно, не мають однакового титру протимікробних антитіл, тому доцільно проводити титрування гамма-глобулінів до різних бактеріальних і вірусних антигенів і відбирати сери, які можуть бути використані для конкретного інфекційного захворювання Такі титровані препарати мають виражену специфічну біологічну та клінічну активність Крім того, відомо, що вираженою профілактичною і лікувальною активністю володіють препарати гамма-глобулінів, одержаних з плазми крові людей, активно пперімунізованих ВІДПОВІДНИМИ мікробними антигенами Це препарати специфічної або направленої дії (див А Е Киселев, Г Я Розенберг, П С Васильєв, Д М Гроздов, В А Аграненко, А А Фром Справочник по кровезаменителям и препаратам крови М , Медицина, 1969, с 152-161 ) У комерційних препаратах імуноглобуліну містяться антитіла проти токсинів багатьох вірусів, та проти ряду збудників бактеріальної природи (еширіхи, сальмонели, шигелли) Але справа у тім, що для лікування бактеріальних захворювань краще використовувати препарати, збагачені імуноглобулінами класів М та/або А, а для лікування вірусних захворювань - імуноглобулінові препарати, в яких переважають імуноглобуліни класу G Таким чином, способи одержання імуноглобулінових препаратів також вимагають диференційованого О 42121 підходу в залежності від того, проти яких агентів спрямований препарат Відомий спосіб отримання комплексного імуноглобулінового препарату з осаду Б (III фракції Кона), що являє собою баластну фракцію при спиртовому фракціонуванні сироватки (Экспериментально-производственный регламент №33891 иммуноглобулин человека сухой, для энтерального применения, утв 06 09 91) Спосіб передбачає сольову екстракцію осаду Б у 0,9%-ному розчині хлориду натрію (у співвідношенні 110, тобто у десятикратному об'ємі) Обробку екстракту осаду Б ведуть хлоридом (10% по об'єму) з декстрансульфатом (0,1%) з метою видалення ліпопротеїдів і подальшого осадження імуноглобулінів поліетиленгліколем Препарат, одержаний згідно з цим способом, містить 55-60% Ig G, 25-30% Ід М, 1520% Ід А Він МІСТИТЬ ВИСОКІ титри антитіл проти ряду ентеробактерій (ешеріхій, шигел, сальмонел), але він майже не придатний для лікування вірусних інфекцій, оскільки має низький вміст Ig G, до якого саме і відносяться вірусспецифічні антитіла шляхом використання способу, що відповідає одержанню препарату точно направленої дії Задача вирішується тим, що спосіб одержання імуноглобулінового препарату проти TORCH-IHфекцій передбачає спиртову обробку етиловим спиртом фракції II + III, що утворюється при спиртовому фракціонуванні плазми крові нативних невакцінованих донорів, з подальшим поетапним центрифугуванням та відокремленням цільового продукту, який відрізняється тим, що передбачає встановлення диференційовано рН на етапі відокремлення протромбіну рН встановлюють на рівні 5,0, а на заключному етапі виділення осаду гаммаглобуліну рН встановлюють рівним 7,2, після чого суміш піддають центрифугуванню спочатку при 1,5 тис об/хв протягом ЗО хвилин, а потім при 3,0 тис об/хв протягом 45 хвилин Спосіб забезпечує одержання імуноглобулінового препарату специфічної дії з вмістом Ig G на рівні 98% Рівень антитіл до HSV 1/2 складав не нижче 150 IU/ml, до CMV - не нижче 50 IU/ml, до токсоплазмозу - не нижче 1000 IU/ml На СЬОГОДНІШНІЙ день встановлено, що вірусспецифічні антитіла грають суттєву роль у патогенезі TORCH-шфекцій Захисну дію їх пов'язують з їх безпосередньою участю у нейтралізації вірусних антигенів, а також з активацією комплемент-опосередкованого лізису та антитіло залежної клітинно-опосередкової цитотоксичності по відношенню до інфікованних клітин Відомий спосіб одержання імуноглобуліну до цитоме галові русу з плазми крові невакцінованих донорів (Патент США №4,617,379) Вказаний спосіб передбачає відбір свіжої плазми нативних донорів з високими титрами антитіл до цитомегаловірусу і подальше її фракціонування за методом Conn та Oncley (Conn et al , J Am Chem Soc 68, 459 (1946) з метою одержання фракції II, що представляє собою пперімуний цитомегаловірусний імуноглобулін, що має титр антитіл до CMV 1 150000 - 1 1225000 Але недоліком способу є, по-перше, недостатньо високий титр антитіл, а, подруге, він не дозволяє одержувати препарат вільний від імунологічно неактивних білкових фракцій, присутність яких у препараті викликає алерпзацію організму Слід сказати, що фракція II + III містить фібрин та Ig G, сумарний вміст яких складає 95%, Ід М, Ід А, складають приблизно 5% За допомогою запропонованого способу, що передбачає використання диференційованого рН, а саме 5,0 на етапі відокремлення протромбіну і 7,2 на стадії одержання осаду гамма-глобуліну, а також використання певного режиму центрифугування спочатку протягом ЗО хвилин при 1,5 тис об /хв , а потім протягом 45 хвилин при 3,0 тис об/хв досягається більш повне розщеплення фракції II + III, що дає змогу збільшити КІЛЬКІСНИЙ ВИХІД імуноглобуліну класу G, що є дуже важливим для імуноглобулінових препаратів, спрямованих проти TORCHінфекцій Найбільш близьким до запропонованого способу є відомий спосіб одержання препарату протигерпетичного імуноглобуліну людини (Патент RU №20510554, 2712 1995), який передбачає використання фракції III Кона, що утворюється при фракціонуванні плазми замість цільної плазми донорів, що коштує досить дорого Спосіб передбачає спиртову обробку плазми 8-, 25-, 17% розчином етилового спирту з подальшим центрифугуванням і виділенням цільового продукту, при цьому спосіб передбачає обробку водного осаду фракції III хлороформом та декстрансульфатом, після чого проводять фракціонування розчином поліетиленгліколю Але спосіб передбачає використання багатьох реактивів і є достатньо складним, крім того, він не дає змоги одержати препарат з високим титром антитіл Задачею винаходу є створення препарату для лікування захворювань, викликаних TORCH-IHфекціями, з високими титрами/рівнями вірусспецифічних антитіл та антитіл проти токсоплазм дами Спосіб пояснюється наступними прикла Приклад 1 Було обстежено 20 жінок, 5 з яких страждали хронічною герпетичною інфекцією За аналізами крові визначили високий діагностичний рівень антитіл до HSV 1/2 типу, Відібрані жінки здали по 400 мл крові, з якої виділяли фракцію ІІ+ІІІ Переосадження білків фракції II + III Осад білків фракції II + III, що зберігався не більше 1 міс при температурі -20 °С розчиняли у попередньо охолодженому до 0 °С фізіологічному розчині із розрахунку 7,5 V фізіологічного розчину по відношенню до ваги осаду Суспензію перемішували протягом 2 год при 0 °С 95% етиловий спирт, охолоджений до температури -15 -20 °С у КІЛЬКОСТІ 240 мл додавали на 1 л суспензії Кінцева концентрація спирту у суміші 19% Суміш перемішували 2 год при температурі -5 -6 °С Осад відокремлювали центрифугуванням при ЗО тис об/хв протягом ЗО хв Виділення осаду протромбіну Осад суспензували при перемішуванні у воді при t = 0 - 1°С із розрахунку 2 л води на 100 г осаду протягом 2 год Встановлювали рН суміші на рівні 5,0 за допомогою буферної суміші Перемішували 3 год при t = 0 °С Осад відокремлювали центрифугуванням у рефре-жераторних центрифугах при t = 0 °С при 3,0 тис об /хв протягом ЗО 42121 хв Протромбін складає ЗО - 40 г на 100 г фракції II + III Виділення р-глобулінута ліпопротеїдів Центрифугат поміщали у скляну ємкість при t = 0 °С та додавали охолоджений до t = -15 -20 °С 95% етиловий спирт із розрахунку 160 мл на 1 л центрифугату Кінцева концентрація спирту у суміші 13% Суміш витримували 13-16 год Осад рглобуліну та ліпопротеїдів видаляли шляхом центрифугування при t = 5°С при 3,0 тис об/хв протягом ЗО хв Одержання осаду у-глобуліну Центрифугат поміщають у скляну ємкість, додають 5 М розчин NaCL із розрахунку 10 мл на кожний літр центрифугату Встановлюють рН рівне 7,0 шляхом додання 4,2% розчину бікарбонату Na, додають охолоджений до t = -15 -20 °С 95% етиловий спирт у КІЛЬКОСТІ 160 мл на 1 л суспензії Кінцева концентрація спирту у суміші 26% Суміш перемішують 2 год Осад фракції II ( у-глобулін) відокремлюють центрифугуванням при t = -5 °С при 1,5 тис об/хв протягом ЗО хв та подальшим центрифугуванням при 3,0 тис об/хв протягом 45 хв Вихід сирого осаду у-глобуліну із 100 г фракції II + III складає 30-40 г Осад зважують і розчиняють у розчині 0,1% NaCI при t = 0 °С із розрахунку 40 мл на 10 г осаду Одержаний розчин розливають по 200 мл у флакони МІСТКІСТЮ 500 мл, закривають пробками та піддають заморожуванню та висушуванню Кінцеву концентрацію специфічних у-глобулінів перевіряли методом ELISA-тесту РІВНІ антитіл в одержаному імуноглобуліновому препараті складають для CMV - не 8 менш 50 IU/ml, для HSV 1/2 - не менш 150 IU/ml, для токсоплазми - не менш 1000 IU/ml Одержаний вміст антитіл є не нижчим від захисного рівня, встановленого для кожної інфекції Це дозволяє використовувати його для профілактики та лікувального призначення при захворюваннях, що викликані TORCH-шфекціями При порівнянні препарату, одержаного методом по способу-прототипу і препарату, одержаного згідно з запропонованим способом, встановлено, що у першому випадку КІЛЬКІСТЬ імунологічно неактивних домішок складає приблизно 3%, у другому випадку 1,5 - 2%, що дає можливість говорити, що спосіб забезпечує одержання імуноглобулінового препарату, що має вищий вміст Ig G у порівнянні зі способом-прототипом Одержання препарату продемонстровано на прикладі імуноглобуліну, специфічного до герпетичної інфекції, решту препаратів отримують аналогічним чином Приклад 2. Дитина Оксана Г, 6 років, діагноз - правосторонній герпетичний увеїт Хворіє на протязі 6 МІСЯЦІВ, за цей час зір знизився до 0,3 Д, а на мо мент звернення у клініку, зір на праве око - відсутній ЕТІОЛОГІЧНИЙ діагноз захворювання підтверджений на підставі виявлення ДНК HSV методом PCR в сльозі і крові Лікування людський гамма-глобулін направленої дії проти HSV з рівнем антитіл 182 IU/ml у дозі 6 мл внутрішньом'язово щоденно на протязі 5 днів Лікування було проведено на фоні загальноприйнятої терапії герпетичної інфекції На четвертий день лікування дитина почала розрізняти світло, а після 2-х тижнів дівчинка могла рахувати пальці руки Приклад З Новонароджений Р , 5 днів, народився недоношеним, маса тіла 2 кг 300 г, зріст 43 см з ознаками внутрішньоутробного інфікування крововилив у шлунок мозку, жовтяниця, температура, збільшення лімфовузлів та печінки При обстеженні матері і дитини встановили активну форму цитомегаловірусної інфекції (CMV) Лікування людський гамма-глобулін направленої дії з рівнем антитіл проти CMV 80 IU/ml, в дозі 1,0 мл внутрішньом'язово щоденно на протязі 5 днів на фоні відповідної базисної терапії Через 7 днів жовтяниця пройшла, в крові і сечі перестала визначатися ДНК CMV (методом PCR) Приклад 4 Жінка С , 33 років, вагітність 32-33 тижнів У зв'язку з субфебрилітетом і збільшенням периферійних лімфовузлів була тестована на основні TORCH-інфекцм Діагностовано хронічний токсоплазмоз в стадії реактивацм виявлені антитіла до Тох gondn класів Ig G, М и А При проведенні УЗО виявлені непрямі ознаки загрози внутрішньоутробного інфікування плоду і переривання вагітності Лікування гамма-глобулін людини направленої дії з рівнем антитіл проти Тох gondn 1078 ш/ml в дозі 15 мл внутрішньом'язово щоденно на протязі 5 діб Вагітність у пацієнтки закінчилася народженням в строк живої доношеної дитини з нормальною масою і довжиною тіла без КЛІНІЧНИХ І лабораторних ознак уродженого токсоплазмозу Аналогічний ефект продемонстровано при використанні пперімунного гамма-глобулінового препарату до вірусу Епштейна-Барра Приклад 5 Пацієнт Ч , 52 років, діагноз - оперезуючий лишай, хронічна (7 років) безперервно рецидивуюча течія Багаторазово приймав противовірусні (ацикловір, зовіракс) та імуномодулюючі (циклоферон) препарати з обмеженим КЛІНІЧНИМ ефектом довго зберігався больовий синдром і висипи Останнє загострення набуло розвитку за 3 дні до звернення в клініку Лікування монотерапія гамма-глобуліном людини направленої дії з високим рівнем антитіл проти віруса оперезуючого герпесу (HZV) в дозі 0,3 мл на кожен кг маси тіла (17 мл на добу), внутрішньом'язово щоденно на протязі 5 днів Спостерігався виражений найближчий позитивний КЛІНІЧНИЙ ефект - больові відчуття зникли на протязі перших 2-5 днів лікування, висип - на протязі 8 днів (без нових "підсипань") Приклад 6 Пацієнтка Т, ЗО років, з обтяженим акушерським анамнезом (дві "замерші" вагітності в 1997 р і 1999 р) і КЛІНІЧНИМИ проявами з 1998 р синдрома хронічної втоми, тривалим субфебрилітетом При обстеженні діагностована хронічна рецидивуюча Епштейна-Барра вірусна (EBV) інфекція в стадії клінічно-лабораторної активації (в крові методом PCR виявлена DNA EBV) Лікування людський гамма-глобулін направленої дії з високим рівнем антитіл проти EBV в дозі 42121 0,3 мл/кг (15 мл одноразово на добу) внутрішньом'язово щоденно на протязі 5 днів, а потім ще два введення у тій самій дозі 15 мл на добу з штервалом 7 днів На 8-й день лікування в крові припинила виявлятися DNA EBV, клінічне одужання - через 1 місяць Запропонований спосіб дозволяє отримувати імуноглобуліновий препарат проти TORCH-IHфекції шляхом використання фракції II + III плазми крові невакцінованих донорів при використанні методу фракціонування за допомогою етилового спирту та встановлення в залежності від стадії одержання певного значення рН та диференціиних режимів центрифугування Тираж 50 екз Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м Ужгород, вул Гагаріна, 101 (03122) 3-72-89 (03122) 2-57-03