Спосіб одержання плазміногену

Винахід відноситься до галузі біотехнології одержанні очищених білкових препаратів, і може бути використаний в медико-біологічній промисловості, наприклад, на станціях переливання крові, заводах по виробництву бакпрепаратів, а також в науково-дослідних лабораторіях. Препарат очищеного плазміногену використовується в медичній клінічній практиці для досліджень фібринолітичної активності плазми крові, визначення активності активаторів фібринолізу та його інгібіторів, в наукових лабораторіях медико-біологічного просиплю при дослідженні існуючих та розробці нових тромболітичних препаратів. На даний момент вітчизняна промисловість не випускає препаратів очищеної о плазміногену людини. Відомі способи одержання очищеного плазміногену людини шляхом афінної хроматографії на сорбентах, що містять в якості ліганда залишки L-лізину, а носієм служить сефароза [1], біогель [2], целюлоза і карбоксиметилцелюлоза [3], кремнезем [4]. Сорбцію нлазміногену з розчинів проводять при рН 7-9, домішкові білки видаляють промиванням сорбенту 0,5М розчином натрію хлориду. Специфічну десорбцію плазміногену здійснюють 0,2М-0,25М розчином Î-амінокапронової кислоти структурним аналогом бокового ланцюга L-лізину. Серед перерахованих носіїв виділяються кремнеземні макропористі матриці з регульованим розміром пор. Вони достатньо жорсткі, хімічно інертні, термостійкі, а хроматографічні сорбенти на їх основі легко регенеруються, витримують високу швидкість пропускання розчинів з достатньою специфічною ємкістю по відношенню до речовин, які необхідно сорбувати, не піддаються гідролізу мікроорганізмами. Найближчим по сукупності ознак, подібних до сукупності суттєвих ознак даного винаходу є спосіб одержання плазміногену, який полягає в пропусканні через колонку з L-лізин-силохромом екстракту фракції 111 плазми крові за Коном [5]. Для здійснення цього способу осад фракції III за Коном екстрагують 0,05М Тріс-НСІ буферним розчином, рH 8,0, що містить 0,5M натрію хлориду. Потім екстракт пропускають через колонку з амінопропілсилохромом, промивають 1М розчином натрію хлориду і здійснюють елюцію плазміногену 0,25М розчином Î-амінокапронової кислоти. Одержаний розчин плазміногену діалізують проти вихідного буферного розчину і пропускають через колонку з афінним сорбентом L-лізин силохромом, промивають 1М розчином натрію хлориду і десорбують плазміноген 0.25М розчином Î-амінокапронової кислоти. Недоліками способу-прототипу є наступні: 1. Для досягнення високої очистки плазміногену проводиться двоетанна хроматографія - на амінопропілсилохромі та L-лізин силохромі. Використання тільки останнього етапу не дозволяє досягнути вищого ступеню очищення плазміногену у порівнянні з [4|. 2. Одержаний за даним методом плазміноген за результатами електрофоретичних досліджень містить до 58% плазміну активної форми ферменту, - яка з'являється в процесі автокаталітичної активації плазміногену при його тривалому виділенні. Плазміноген з домішками плазміну непридатний для ряду діагностичних досліджень, не може бути використаний для одержання ефективних тромболітичних агентів, погано зберігається в розчинах, швидше втрачає свою потенційну активність в замороженому та ліофілізованому стані у порівнянні з вільним плазміногепом. 3. Двоетапність хроматографії зменшує кінцевий вихід продукту внаслідок втрат на кожному з етанів. 4. Недостатня десорбція баластних білків 0,5-1,0М розчином натрію хлориду з сорбенту приводить до зменшення на кінцевому стані питомої активності плазміногену. 5. При елюції плазміногену 0,25М розчином Î-амінокапронової кислоти з L-лізин-силохрому профермент виходить доволі широким піком у великому об'ємі розчину, внаслідок чого концентрація плазміногену складає лише 0,3мг/мл (по білку). Задачею даного винаходу є підвищення ступеню очищення плазміногену, збільшення його кінцевого виходу, спрощення технології внаслідок одностадійності, і, як наслідок, одержання плазміногену без домішок плазміну. Поставлена задача досягається запропонованим способом одержання плазміногену, яка включає одержання екстракту осаду (фракції ІІІ за Коном, пропускання екстракту через колонку з L-лізин-силохромом, десорбцію баластних білків 25% розчином ізопропанолу, естрагуючим буферним розчином, 0,5М розчином натрію хлориду, елюцію плазміногену 0,25М розчином Î-амінокапронової кислоти в присутності 0,5М розчину натрію хлориду, діаліз одержаного розчину та ліофілізацію. Відмінність запропонованого способу полягає у десорбції баластних білків з L-лізин-силохрому розчинами у наступній послідовності: 25% ізопропанол, вихідний буферний розчин, 0,5М натрію хлорид; та елюції плазміногену з сорбенту 0,25М розчином Î-амінокапронової кислоти в присутності 0,5М натрію хлориду. Додаткове у порівнянні з прототипом промивання L-лізин-силохрому зі зв'язаним плазміногеном 25% розчином ізопропанолу та вихідним буферним розчином дозволяє підвищити ступінь очищення плазміногену на 10-30%) за рахунок додаткового видалення баластних білків. Елюція плазміногену 0,25М розчином Îамінокапронової кислоти в присутності 0,5М нагрію хлориду підвищує селективність десорбції і зменшує час виконання процедури - плазміноген збирають в невеликому об'ємі з високою концентрацією білка. Такий розчин швидше піддається діалізу. Зменшення часу виділення плазміногену в 2-3 рази у порівнянні з аналогічним способ дозволяє одержати профермент без домішок плазміну. В наведених прикладах кількість білка наведена в мг, активність плазміногену визначена після його активації стрептокіназою по гідролізу азофібрину [6]. За одну фібринолітичну активність приймали гаку кількість ферменту, яка при гідролізі азофібрину в стандартних умовах викликала приріст оптичної густини при довжині хвилі 440нм, рівний одиниці, за одну годину. Приклад 1. 10г осаду фракції III плазми крові людини за Коном екстрагують 100мл 0.05М Тріс-НСІ буферного розчину, рН 8,0, що містить 0,15М натрію хлориду, протягом 4 год при + 4°С. Екстракт центрифугують при 6000g протягом 30хв. Супернатант пропускають через колонку (1,3х4см) з L-лізин-силохромом, врівноважену вихідним буферним розчином) зі швидкістю 0,75мл/(см2×хв.) і послідовно промивають наступними розчинами: 1) 0,05М ТрісНСІ буферний розчин, рН 8,0, що містить 25% ізопропанолу; 2) 0.05М Тріс-НСІ буферний розчин, рН 8,0; 3) 0,05М Тріс-НСІ буферний розчин, рН 8,0, що містить 0,5М натрію хлориду. Промивання кожним розчином здійснюють до моменту, коли оптична густина розчину, що виходить з колонки, при довжині хвилі 280 нм, знижується до 0,05 одиниць. Елюцію плазміногену проводять 0.05М Тріс-НСІ буферним розчином, рН 8,0, що містить 0,25М Îаміноканронової кислоти та 0,5М натрію хлориду. Одержаний розчин плазміногену діалізують проти вихідного буферного розчину і ліофільно висушують. Вихід плазміногену - 22мг, питома активність - 9,2од./мг білка В таблиці представлені характеристики плазміногену одержаного пропонованим способом і способомпрототипом. Таблиця Властивості спосіб Приклад 1 прототип Кількість елюату Концентрація Питома ФА з плазміногеном, білка в елюаті, плазміногену, мл мг/мл од./мг білка 25±6 0,9±0,2 9,2±1,1 100±14 0,3±0,2 6,1±0,7 Вихід Спонтанна ФА плазміногену, плазміногену (по ФА),% (домішки плазміну), % 92±4 0,03±0,12 76±9 1.5±3,0 Примітки: ФА - фібринолітична активність З наведених в таблиці даних видно, що ступінь очищення плазміногену, яка характеризується підвищенням його питомої фібринолітичної активності, вища в 1,3-1,5 рази в пропонованому способі. Продуктивність способу - вихід сумарної фібринолітичної активності у порівнянні з активністю екстракту фракції III - для пропонованого способу в 1,2-1,4 рази вища, ніж у прототипу. Відсутність спонтанної фібринолітичної активності (домішок плазміну) в препараті плазміногену, одержаного даним способом, па відміну від способу-прототипу - ще одна з переваг пропонованого способу. Скорочення часу виділення плазміногену значно здешевлюють пропонований спосіб, елюція плазміногену в меншому об'ємі спрощує к технічному виконанні наступні роботи (діаліз, ліофілізацію), внаслідок чого покращуються аналітичні показники кінцевого продукту діагностичного чи лікувального препарату. Література, прийнята до уваги при складанні заявки: 1. Deutsch E.G., Mertz E.I. Plasminogen. Purification from human plasma by affinity chromatography//Science, 1970,v. 170, pp. 1095-1096. 2. Rickli E.E. Human plasminogen: a summary of studies on its isolation, characterization and activation mechanism//Immunochemistry, 1975, v. 12, pp.629-632. 3. Кудинов С.А., Ерецкая Е.В., Позднякова Т.М. и др. Аффинные сорбенты для получения плазминогена /Укр. биохим. журн., 1979, т. 51, с.330-334. 4. Староверов С.М., Лисичкин В.А., Малиновский В.А., Гайда A.В. и др. Сорбент для выделения плазминогена. А. с. 1309584, СРСР. 5. Гайда А.В., Монастырский В.А., Магеровский Ю.В., Самарский В.А. и др. Способ получения плазминогена. А. с. 1325746, СРСР. 6. Гайда А.В., Монастырский В.А., Магеровский Ю.В., Даныш Т.В. Способ определения фибринолитической активности. А.с. 1255641, СРСР.