Спосіб диференціації штамів та ізолятів вірусу хвороби марека

Винахід, що передбачається, відноситься до ветеринарної вірусології, зокрема, з розробки способу визначення серотипу циркулюючого вірусу по особливостях специфічної цитопатичної дії на культури первинних фібробластів ембріонів різних видів сільськогосподарської птиці. Хвороба Марека (ХМ) - хронічне лімфопроліферативне захворювання сільськогосподарської та дикої птиці, що проявляється нервовими ознаками і утворенням локальних та генералізованих Т-лімфом в органах грудочеревної порожнини. ХМ наносить значні економічні збитки, що складаються з відходу хворої птиці, бракування продукції та застосування імунопрофілактики. Етіологічним чинником ХМ є a-герпесвірус виду Gallid Herpesvirus type 2 (І та II серотипи) і Turkey Herpesvirus (III серотип). Своєчасне з'ясування серотипу циркулюючого вірусу та диференціація вакцинних і епізоотичних штамів дає змогу визначити найбільш ефективну схему застосування вакцин у конкретному господарстві. Для диференціації штамів вірусу хвороби Марека існує ряд методичних прийомів, таких, як реакція дифузійної преципітації (РДП), імуно-ферментний аналіз (ІФА), полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). Є спосіб серологічної диференціації в РНГА (В.Н. Сюрин и др. Диагностика вирусных болезней животных, Москва, 1991). Це рішення може бути прототипом заявляємого способу диференціації штамів та ізолятів вірусу хвороби Марека та герпесу індиків. Недоліком прототипу є неможливість використання його в разі відсутності специфічних діагностикумів. Індикацію вірусу проводять на первинно трипсинізованих фібробластах ембріонів курей (ФЕК). Ця культура використовується широко в світі не тільки для виділення вірусу ХМ, а і збудників більшості вірозів птиці. В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб диференціації штамів та ізолятів вірусу хвороби Марека з використанням штамів FC-126 (III серотип), SBG (II серотип) та ізолят штаму CVI/Rispens (І серотип) шляхом обліку наявності і порівняння характеру ЦПД на культурах фібробластів ембріонів різних видів сільськогосподарської птиці, щоб забезпечити диференціацію штамів та ізолятів вірусу хвороби Марека та вірусу герпесу індиків. Спосіб виконується таким чином. Посилаючись на генетичну різнорідність вірусу ХМ кожного з трьох серотипів, використано власні відомості про прояви різного ступеню цитопатичної дії (ЦПД) на первиннотрипсинізовані фібробласти ембріонів різних видів птиці. З цією метою використано первиннотрипсинізовані культури фібробластів наступних видів ембріонів: SPF - ембріонів курки 11-добової інкубації, перепілки 9-добової інкубації, качки 12-добової інкубації, індички 13-14-добової інкубації. Як вірусний матеріал для перевірки можливості диференціації були використані штами FC-126 (III серотип), SBG (II серотип) та ізолят штаму CVI/Rispens, виділений від імунної проти ХМ 60-добової птиці, що мала антитіла до ВХМ І серотипу. Приклад 1 Для зараження було взято по 12 матрасів об'ємом 50см 3 з виповненим (після 48 годин інкубації) моношаром фібробластів SPF-ембріонів курки, перепілки, качки та індички. Далі по 3 матраси з моношаром кожного виду клітин було інфіковано з використанням штамів FC-126, SBG та C VI/Rispens в дозі 1000 фокусоутворюючих одиниць (ФУО)/см 3. При культивуванні при температурі 38°С протягом 6 діб проведено аналіз впливу означених штамів на кожен конкретний вид первинних фібробластів. При цьому з'ясовано, що вірус кожного серотипу спричиняє характерну ЦПД на спектр культур, не властиву для інши х серотипів (табл.). Оцінку ЦПД проводили мікроскопією моношару в нативному препараті та після фарбування амідовим чорним. При подальшому пасажуванні штамів на відповідних культурах встановлено, що ВХМ штаму SBG не призводить до цитопатичних змін в культурі фібробластів ембріонів індичок і качок. Штам вірусу герпесу індиків FC-126 в культурі проявляє ЦПД в фібробластах ембріонів перепілок, на фоні активного росту клітин, але не адаптується до фібробластів ембріонів качок. Ізолят штаму CVI/Rispens призводить до цитопатичних змін в культурі фібробластів SPF-ембріонів курей, качок та індичок, але не адаптується до фібробластів ембріонів перепілок. Приклад 2 При культивуванні ізолятів, виділених від щепленої бівалентною вакциною зі штамів SB-1 і FC-126, РНГАпозитивної по ХМ птиці 120-добового віку, спостерігали цитопатичні прояви на різних культурах, ідентичні властивим для штаму SBG II серотипу ВХМ. Спосіб диференціації штамів та ізолятів вірусу хвороби Марека та вірусу герпесу індиків може знайти застосування в лабораторіях ветеринарної медицини в разі відсутності спеціальних діагностикумів для визначення належності вірусу до певного серотипу шляхом постановки диференціального діагнозу за наявністю, строками появи і характером ЦПД, що є специфічними для штамів та ізолятів конкретно взятого серологічного типу ВХМ. Це можна вважати диференціальною ознакою при попередній типізації збудника. Таблиця Культура фібробластів: SPF - курки Перепілки FC-126 ІІІ серотип ЦПД проявляється через 36-48год. в вигляді утворення продовгувати х фокусів неправильної форми, до 0,5мм в довжину, з нечітко вираженим подвійним світлозаломленням. Слабко виражена ЦПД появляється через 24 Штами SBG ІІ серотип CVI І серотип ЦПД проявляється через 4872год. в вигляді утворення округло-овальних фокусів, при їх діаметрі до 0,3мм, з добре вираженою ділянкою відхилення світла в центрі. ЦПД проявляється через 7296год. в вигляді дрібних фокусів, 0,125-0,22мм в діаметрі, з відсутністю заломлення світла у 80% бляшок. Теж ЦПД відсутня 48год., її фокуси поліморфні за формою. Качки ЦПД відсутня ЦПД відсутня ЦПД проявляється через 72год. в вигляді дрібних фокусів, 0,18-0,3мм в діаметрі. Індички ЦПД проявляється через 24-36год. в вигляді утворення продовгувато-овальної форми фокусів, до 0,6мм в довжину, та "вікон" в моношарі. ЦПД відсутня Через 48 годин наступає стерта ЦПД в ви гляді дрібних (0,2мм) поліморфних за формою бляшок