Спосіб визначення фуросеміду в плазмі крові

Винахід відноситься до аналітичної хімії, зокрема аналізу біологічних рідин на вміст в них діуретичного засобу - фуросеміду (ФР). Відомо визначення фуросеміду по сенсибілізованій люмінесценції іонів Тb в етанольних розчинах (див. Кравченко Т.Б. и др. Способ количественного определения фуросемида. А.С. СССР №1603258, 1990г.) Вказаний спосіб передбачає взаємодію фуросеміду з хлоридом тербію при рН=6,3-6,8 і реєстрацію інтенсивності люмінесценції в етанольних розчинах. Але, комплекс, який утворюється, недостатньо стійкий в розчинах, а тому визначення ФР в плазмі крові неможливе. Крім того, багато компонентів плазми крові гасять люмінесценцію комплексу. Відомий також спосіб визначення фуросеміду по люмінесценції іонів Тb(ІІІ) в присутності донорно-активної добавки-триоктилфосфіноксиду (ТОФО) і нейтральної поверхнево-активної речовини тритону Х-100 (див. Arnaud N., Georges J., Analytica Chim. Acta, 2003 (476), p.149-157). Цей спосіб призначений для післяколоночного виявлення ФР в плазмі крові після його відокремлення методом високоефективної колоночної хроматографії. Це вимагає дорогого обладнання. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб, що передбачає визначення ФР в плазмі крові після попереднього вилучення білків (див. P.C.Joannon, N.V.Rusakova, D.A.Andrikopoulon, K.M.Ge ynon, G.M.Tzompanaki. Analyst. 1998. p.2839-2843). Визначення здійснюють таким чином. До 0,25мл плазми крові додають 0,06мл 8,5моль/л оцтової кислоти, струшують, додають 2,0мл етилацетату. Розчин витримують 20 хвилин і центрифугують 15 хвилин при частоті обертів 1500. Далі 1,7мл органічної фази відбирають у скляну посудину і випаровують в потоку азоту при 40°С. До проби додають 2,0мл 2×10-3моль/л розчину хлориду тербію в метанолі в l = 350нм присутності триетиламіну і записують інтенсивність люмінесценції при l = 550нм при в од. проти розчину холостого досліда. Даний спосіб обрано прототипом. Прототип співпадає з винаходом, що заявляється, в наявності спільних операцій: - відбір проби; - виділення фуросеміду; - взаємодія фуросеміду з розчином хлориду тербію; - вимірювання інтенсивності флуоресценції розчину. Але спосіб за прототипом вимагає попереднього відокремлення білків з використанням концентрованої оцтової кислоти (8,5моль/л). Крім того, спосіб передбачає випаровування в потоку азота. Перелічене ускладнює спосіб. Окрім того у способі застосовується метанольний розчин хлориду тербію. Метанол є токсичною речовиною і виконання робіт з метанолом в лабораторії є небажаним. В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб, в якому шляхом більш ефективного метода виділення фуросеміду забезпечити спрощення способа, скорочення тривалості аналіза та зниження межі виявлення. Поставлена задача вирішена в визначення фуросеміду в плазмі крові, що включає відбір проби, виділення фуросеміду, взаємодію його з розчином хлориду тербію і вимірювання інтенсивності флуоресценції розчину тим, що фуросемід виділяють шляхом тонкошарової хроматографії, а взаємодію його з розчином хлориду тербію здійснюють в присутності цетілтриметиламоній хлориду при рН=6,3-6,7. Новим у винаході, що заявляється, є використання метода тонкошарової хроматографії для відокремлювання фуросеміду від основи та проявлення хроматограми розчином хлориду тербію в присутності цетілтриметиламоній хлориду. Це дозволило спростити спосіб, виключити токсичний розчинник - метанол, знизити межу виявлення фуросеміду та скоротити час аналізу. Спрощення і скорочення часу виконання аналізу стало можливим завдяки таких причин. Застосування метода тонкошарової хроматографії дозволило виключити стадію попереднього виділення білків з проби, а також виключити наступну обробку проби в потоку азота. Використання розчину хлориду тербію як проявляючого реагента в присутності цетілтриметиламоній хлориду зумовлює появу на хроматографічній люмінесценції іону тербію Тb(III) в присутності фуросеміду, яка з'являється на твердій матриці внаслідок внутрішньомолекулярної передачі енергії збудження від фуросеміда до іона Тb(III). Цетілтриметиламоній хлорид дозволяє підсилити Ілюм.Тb(ІІІ) в 6,5 разів. Іони Тb(ІІІ) в розчинах простих солей проявляють люмінесценцію, яка зумовлена переходом електронів 4fоболонки. Але інтенсивність їх люмінесценції невелика через те, що сили осциляторів цих переходів малі. Органічні ліганди, поглинаючи енергію збудження, можуть передавати її на іони лантанідів, підсилюючи її на 3-4 порядка величини. Фуросемід має в УФ-області спектру смуги поглинання з максимумами при 280 і 350нм, що зумовлює ефективне поглинання енергії збудження. Ця енергія передасться з триплетного рівня ліганда (Е=21598см -1) на енергетичний рівень Тb (Е=20500см -1), що призводить до значного зростання Ілюм. Тb. Передача енергії здійснюється і в твердій фазі, тому на хроматографічній пластинці виявляється інтенсивна люмінесценція Тb ІІІ) в присутності фуросеміду. Використання катіонної поверхнево-активної речовини - цетілтриметиламоній хлориду сприяє дегідратації комплекса, який утворюється і, за рахунок цього, зниженню втрат енергії збудження. Це призводить до збільшення інтенсивності люмінесценції іону Тb(ІІІ). Вибір поверхнево-активної речовини (ПАР) проведено експериментально. Дослідження впливу різних ПАР і ТОФО на інтенсивність люмінесценції Тb(ІІІ) на хроматографічній пластині показало, що найбільша Ілюм. Тb(ІІІ) проявляється в присутності ЦТА. Дані наведені в таблиці 1. Таблиця 1 Вплив ПАР і ТОФО на Ілюм. Тb(ІІІ) в присутності фуросеміду на хроматограмі ПАР, ТОФО Цетілтриметиламонію хлорид Цетілпірідінію хлорид Додецилсульфат натрію Цетілсульфат натрію Твін-80 Тритон X-100 ТОФО При відсутності добавки Ілюм. відн. од. 100 95 15 40 16 24 52 15 Комплексна сполука Тb(ІІІ) з фуросемідом утворюється в слабкокислому середовищі при рН=6,3-6,7. Слабкокисле середовище створюють 4%-вим розчином уротропіну. Приклад Визначення фуросеміду проводили на модельному розчині шляхом введення в плазму крові заданої кількості фуросеміду. 1мкл. аналізуємої плазми крові наносять мікрошприцем на лінію старта пластинки розміром 25х80мм. Паралельно на пластинку наносять стандартний розчин фуросеміду з концентрацією 5-10-4моль/л. Пластинку підсушують і вміщують в хроматографічну камеру в рухому фазу (суміш толуол: ацетонітрил: метанол: мурашина кислота при їх співвідношенні рівному 15:5:1:1 відповідно). Коли фронт розчинника досягає висоти 70мм пластинку дістають з камери і відмічають фронт розчинника. Отриману хроматограму висушують і рівномірно обробляють проявляючим розчином. Проявляючий розчин готують шля хом змішування 1мл розчину хлориду тербію з концентрацією 0,01моль/л, 0,2мл 4%-го уротропіну і 0,5 ЦТМА з концентрацією 0,01моль/л і розбавлення дистильованою водою до об'єму 10мл. Після цього пластинку знову висушують. Іденти фікацію фуросеміду на пластинці проводять по появі зеленої люмінесценції Тb(ІІІ) під люмінесцентною лампою, візуально зрівнюючи Ілюм. проби і стандарту. Кількісне визначення фуросеміду проводять по калібровочному графіку. Калібровочний графік будують таким чином: на пластинку наносять різні кількості стандартного розчину фуросеміду і проводять хроматографування і проявлення хроматограми, як це описано вище. Після цього з пластинки вирізають плями з фуросемідом, вміщують в кювету для твердих зразків і виміряють інтенсивність люмінісценції при l = 545нм . За отриманими даними Ілюм. Tb(III) - концентрація фуросеміду будують калібровочний графік, по котрому визначають вміст фуросеміду в аналізуємій пробі. Чутливість визначення фуросеміду в плазмі крові визначена на модельних розчинах з використанням стандартних розчинів фуросеміду. Вона складає 0,03мкг/мл. Точність і достовірність визначення фуросеміда в плазмі крові перевірена методом статистичної обробки результатів аналізу. При n=5, р=0,95 величина відносного стандартного відхилення Sr складає 0,01-0,05. Результати визначення фуросеміду в плазмі крові були перевірені також методом "введено-знайдено", який підтвердив хороше відтворювання способу. Дані наведені в Таблиці 2. Таблиця 2 Результати визначення фуросеміду методом "введено-знайдено" Введено 10 20 30 Знайдено 9,98±40,60 20,03±10,50 30,97±0,40 Sr 0,05 0,03 0,01