Спосіб визначення активності протеолітичних ферментів трипсиноподібної дії в сироватці крові людини

Винахід відноситься до медицини, а саме до лабораторної діагностики і може бути використаний для оцінки стану системи протеолізу макроорганізму. Відомий спосіб визначення активності протеолітичних ферментів трипсиноподібної дії у сироватці крові, а також комерційних зразках протеїназ, з використанням в якості субстрату ВАЕЕ (Na -бензоїл-L-аргінин-етиловий ефір) [Веремеенко К.Н., Голобородько О.П., Кизим А.И. Протеолиз в норме и при патологии. - К.: Здоров'я, 1988. 200с.]. В результаті ферментативного гідролізу ВАЕЕ утворюється ВА (Na -бензоїл-L-аргінин), який має більш високі показники молярної екстинції (оптичну щільність) ніж ВАЕЕ при довжині світової хвилі 253нм (ультрафіолетова частина спектру світла). Однак суттєвими недоліками відомого способу є необхідність використання спектрофотометру та термостатуємого кюветного блоку для спектрофотометру; необхідність охолодження реакційної суміші при температурі довкілля вище ніж 25°С; необхідність використання одночасно ВАЕЕ та ВА; застосування ультрафіолетової частини спектру при фотометрії; необхідність і складність створення каліброваного графіку та не уніфікована розмірність одержаних результатів; відсутність можливості застосування для масових досліджень. В основу винаходу поставлено задачу створити спосіб визначення активності протеолітичних (ферментів трипсиноподібної дії в сироватці крові шляхом використання здатності протеїназ сироватки крові гідролізувати субстрат BAPN A (Na -бензоїл-DL-аргінин-паранітроанілід гідрохлорид) з утворенням паранітроаніліну, кількість якого можливо розрахува ти при вимірі оптичної щільності реакційної суміші проти контролю на імуноферментному цифровому аналізаторі із світлофільтром 405нм, а по рівню утвореного паранітроаніліну розрахувати за допомогою формул з ура хуванням ступеня розведення сироватки та часу реакції рівень активності протеїназ сироватки крові у розмірності мкМоль/літр/годину (мкМоль/л/г), що забезпечить можливість автоматизації та проведення масових скрінінгових досліджень з максимальною економією реактивів, лабораторного посуду і скорочення часу дослідження. Поставлена задача досягається тим, що в якості субстрату для визначення активності протеолітичних ферментів використовують субстрат BAPNA, ферментативну реакцію проводять у мікроб'ємах в лунках полістирольного планшету або стрипів для імуноферментних досліджень, після гальмування ферментативної реакції додатково за допомогою цифрового імуноферментного аналізатору визначають оптичну щільність продукту реакції - паранітроаніліну в досліджуваному і контрольному зразках сироватки та розраховують за їх даними протеолітичну активність згідно з формулою: А мкМ/л/г = 29032,5 (Езр - Ек ), де А - протеолітична активність сироватки крові; Езр - оптична щільність досліджуваного зразку; Ек - оптична щільність контрольного зразку. Суттєвою відмінністю способу є те, що для визначення оптичної щільності зразків використовують імуноферментний цифровий аналізатор (ІФА) із світлофільтром 405нм, ферментативні реакції проводять замість пробірок у лунках полістирольного планшету для ІФА, що скорочує об'єм реакційної суміші до 250мкл, майже у 10 разів у порівнянні з прототипом, у ході методу відсутній етап осадження білка і центрифугування, відсутня необхідності будування каліброваної кривої та застосування контрольних зразків ферментативної реакції з різними концентраціями трипсину; етап ферментації проводиться в режимі активного перемішування реакційної суміші; є можливість для автоматизованого розрахунку результатів дослідження та придатність для скрінінгових та масових досліджень. Спосіб здійснюється таким чином. Для визначення активності протеїназ використовують зразки сироваток крові у розведенні в 5-7,5 разів (при низьких розведеннях має місце досить висока оптична щільність контролів зразків, а при розведеннях більш ніж у 10 разів, різко знижуються показники оптичного поглинання зразків). Сироватки з гемолізом непридатні для досліджень (високий ступінь поглинання при 405нм). Для уникнення помилок при проведенні тесту перед використанням планшету або стріпів необхідно перевірити в них оптичну щільність порожніх лунок по повітрю. Вона не повинна перевищувати 0,003-0,006 Од. В усі лунки 96-лункового планшету, відведені для проведення тесту, вносять по 100мкл 0,05М фосфатного буферу з рН=7,8. Потім послідовно в кожні 2 суміжні лунки вносять по 50мкл, розведених буфером у 7,5 разів досліджуваних зразків сироваток (одна лунка призначається для проведення реакції, а друга для контролю зразка при спектрофотометрії). Дослідні і контрольні зразки краще відразу позначити на планшеті маркером, щоб уникнути плутанини. Після внесення сироваток, планшет вміщують в шейкер і протягом 10 хвилин інкубують в термостаті при температурі 37°С для прогрівання і підготовки зразків для ферментативної реакції із субстратом BAPN A. Планшет накривають кришкою, щоб не випаровувалася рідина. Далі в усі дослідні зразки вносять по 50мкл робочого розчину BAPN A, а в контрольні по 50мкл 0,5н НСl (BAPNA розчиняють у 0,5мл диметилсульфоксиду до повного розчинення при нагріванні до 50-60°С, а потім доводять до концентрації 3мг/мл, додаючи 0,05М фосфатний буфер до обсягу 5мл). Потім планшет знову вміщують в шейкер і інкубують в термостаті при температурі 37°С протягом 15 хвилин. Після інкубації в "дослідні" лунки для гальмування реакції вносять по 50мкл 0,5н HСl, а в "контрольні" по 50мкл робочого розчину BAPNA. Після цього планшет вставляють у рідер та вимірюють оптичну щільність дослідних і контрольних зразків. Для рідерів-автоматів вимірюють ці показники автоматично у програмі режиму абсорбції. Для кожного зразка сироватки одержують 2 показники: оптичну щільність зразка (Езр), у якому проходила ферментативна реакція і контролю (Ек ). При показниках Езр вище 0,5 Од необхідно збільшити розведення сироватки. Для рідерів-автоматів результати виміру зберігають у виді файлів для програми "Excel" з пакету програм "MS Office" для операційної системи "Windows" та "DOS". Надалі для аналізу і обробки даних використовуються файли для "Excel". Розрахунок протеолітичної активності сироватки проводять спираючись на дані каліброваної кривої, отриманої при вивченні залежності оптичної щільності від кінцевої концентрації зразків p-NA, розчиненого в буфері, без внесення в середовище 0,5н НСl. Дана залежність має вид рівняння y=kx+b, де у - оптична щільність зразка, х - концентрація p-NA і b - оптична щільність "нульового" калібратора (замість p-NA використовувався буфер). У подальших розрахунках оптична щільність "нульового" калібратора не враховується через низькі величини (0,005-0,02). Далі одержують формулу для розрахунку концентрації p-NA. Вона є зворотною до вищевказаної: x=y/k. Підставивши в неї відомі величини, одержують наступну формулу: С=(100/0,775)D, де С - кінцева концентрація p-NA у 250мкл розчину, виражена в мкМ/л; D - різниця між оптичною щільністю цього зразка і контролю, яка дорівнює 0,075 при концентрації p-NA 100 мкМ/л; 100/0,775 - величина зворотна коефіцієнту k (1/k). Потім обчислюють масу p-NA (N), що міститься в 250мкл розчину по формулі: N мкМ = С250/106, підставляють у формулу значення "С", одержують нову (формулу: N мкМ = D/31. Ця формула є базовою для розрахунку протеолітичної активності зразків сироваток. Тепер, знаючи оптичну щільність зразка сироватки в досліді (Езр) і контролі (Ек ), обчислюють кількість p-NA у мкМ, що утворилися з BAPN A за 15 хвилин інкубації з 50мкл розведеної досліджуваної сироватки. У формулу введений коефіцієнт зменшення оптичної щільності зразків p-NA при гальмуванні реакції 0,5 н НСl (у 1,5 рази), який дорівнює - 1,5 і вона стала наступною: N мкМ (за 15 хвилин інкубації) = 1,5(Езр - Ек )/31. У вихідне рівняння, для одержання розмірності активності протеїназ у мкМ/літр/годину (мкМ/л/г), вводять додаткові коефіцієнти з урахуванням тривалості інкубації, ступеня розведення і вихідного обсягу, внесених у лунки планшета зразків сироваток. При розробці способу була відзначена і використана залежність, що пов'язана з додаванням НСl. При додаванні 0,5н НСl оптична щільність зразків знижувалась в 1,5 рази, а при додаванні 1,0н НСl - в 2,6 рази. При відновленні рН кінцевого розчину лугом до 7,0 і вище оптична щільність зразків практично відновлюється. Різке підвищення рН до 12-13 (додавання 1,0 розчину NaOH) практично не впливає на поглинання розчинів p-Na. Це явище цілком з'ясоване. Паранітроанілін по хімічній природі є аміном і може утворювати з кислотами солі, зокрема з HСl - гідрохлорид, а при обробці такої солі лугом із з'єднання знову звільняється р-NA. Природно нове з'єднання має інший спектр поглинання світлового потоку, що не суперечить даним літератури. Так, розчини p-NA змінюють оптичну щільність у залежності від рН розчину. Формула розрахунку протеолітичної активності зразка сироватки по BAPNA має наступний вигляд: А мкМ/л/г = К1*К 2*К3*1,5*(Езр - Ек )/31 де: А - активність протеїназ по p-NA у мкМ/л/г; К1 =7,5 - з урахуванням розведення сироватки в 7,5 разів; К2=4 з урахуванням інкубації протягом 15 хвилин при перерахуванні на 1 годину; К3=106/50 - при перерахуванні 50мкл сироватки на 1 літр. У кінцевому виді формула виглядає так: А мкМ/л/г = 29032,5(Езр - Ек ) або А мМ/л/г =29,0325(Езр - Eк ) Дані вимірів на рідері-автоматі фірми "Human", який має комп'ютерний інтерфейс, або аналогічному можна автоматично записати у файл пакета "Excel" з пакету програм "MS Office for Windows", і після введення у файл формули розрахунку можна автоматично одержати дані дослідження активності протеїназ для кожного зразка сироватки. Спосіб пояснюється такими прикладами. Приклад 1. При дослідженні активності протеїназ сироватки крові клінічне здорової людини оптична щільність розведеного зразка сироватки (Езр) дорівнювала - 0,092 Од, а оптична щільність контролю (Ек ) - 0,071 Од. За розрахунками з застосуванням формули А мкМ/л/г = 29032,5(Езр - Ек ) активність протеїназ досліджуваного зразку сироватки крові дорівнює - 609,68мкМ/л/г. Приклад 2 При дослідженні активності протеїназ сироватки крові хворого на гострий вірусний гепатит В з важким перебігом у гострому жовтяничному періоді хвороби оптична щільність розведеного зразка сироватки (Езр) дорівнювала - 0,219 Од, а оптична щільність контролю (Ек )- 0,109 Од. За розрахунками з застосуванням формули А мкМ/л/г = 29032,5(Езр - Ек ) активність протеїназ досліджуваного зразку сироватки крові дорівнює 3193,56мкМ/л/г. Запропонований спосіб заснований на результатах досліджень протеолітичної активності сироватки крові у здорових людей і хворих на вірусні гепатити. У клінічно здорових осіб (донорів) активність протеїназ сироватки крові склала в середньому - 734,52±164,80мкМ/л/г, у пацієнтів, хворих на вірусні гепатити в гострому періоді хвороби - 3562,74±376,15мкМ/л/г і в періоді реконвалесценції -1456,65±239,94мкМ/л/г. Надійність запропонованого способу оцінювали по його відтворюваності. Для кожної серії досліджень готували "свіжі" реагенти. Для даного способу можливе використання заморожених при мінус 18°С сироваток протягом 1-2 місяців, а при мінус 27°С - 3-х місяців практично без втрати активності. При більш тривалому збереженні заморожених зразків активність протеїназ знижується на 7-11%. Коефіцієнт варіації в серії складав 56% і при повторних щотижневих дослідженнях - 6-6,5%. Спосіб є об'єктивним та відтворюваним. Використання імуноферментного цифрового аналізатору замість спектрофотометра і планшетів для ІФА замість пробірок, відсутність необхідності створення каліброваного графіку та етапу осаду білка і центрифугування, можливість автоматизації виміру оптичної щільності зразків та контролю дозволяє підвищити точність досліджень та більш ніж у 3-4 рази заощадити реактиви, лабораторний посуд, використовувані площі, скоротити час досліджень і вартість скрінінгових та масових досліджень. Застосування розробленого способу дозволяє одночасно проводити дослідження систем протеолізу та антипротеазного захисту, а також максимально наблизити і адаптувати результати досліджень при комплексній оцінці активності та взаємодії цих систем.