Спосіб визначення вінборону у сироватці крові

Спосіб визначення етилового ефіру 5пдрокси-4-диметиламшометил-2-фенілбензофуран-3-карбоновоі кислоти пдрохлориду (вінборону) у пробі сироватки крові, що передбачає фотометрування проби після обробки реагентом, який відрізняється тим, що вінборон попередньо екстрагують з проби бензолом з іонною парою - бромфеноловим синім, одержаний екстракт випаровують, очищають методом тонкошарової хроматографії у системі розчинників бензол-метанол-піридин у співвідношенні 7 1 0,5 за об'ємом та використовують як реагент 0,2-0,5 % розчин п-диметиламінобензальдепду в Винахід відноситься до галузі медицини, тобто до бюаналітичних методів дослідження і може Фути використаний для КІЛЬКІСНОГО визначення вінборону у сироватці крові Вінбирон - етиловий ефір 5-гидроксі-4диметиламшометил-2-фенілбензофуран-Зкарбонова кислота гидрохлорид (ФС 42-2557-88) оригінальний препарат, у закордонних фармакопеях не описан Застосовується при захворюваннях шлункового тракту, супроводжуючихся спазмами гладком'язних органів, хронічних холециститах, хронічної коронарної недостатності в приступами стенокардії [1] У теперішній час ВІДОМІ наступні методи КІЛЬКІСНОГО визначення вінборону титриметричний, заснований на титруванні препарату у 3% розчині мурашиної кислоти у оцтовому ангідриді, 0,1 N розчином хлорної кислоти в присутності індикатора кристалічного фіолетового до появлення жовтого забарвлення [2], фотометричний, заснованими на кольоровій реакції вінборону з реагентом 0,5% розчином нітрозо-Р-солі у концентрованій азотній кислоті [3], екстракційно фотометричний, заснований на утворюванні гидрофобного комплексу вінборону з кислотно-лужним барвником - метилоранжем, екстракції його хлороформом та обробці органичного екстракту 1% спиртовим розчином сірчаної кислоти [4], радювуглецевий, заснований на змішуванні С -радіоізотопно позначеного препарату з лікарською речовиною з наступним виміром виділеного препарату на сцінтиляцінному лічильнику [5] Вище згадані методи мають специфічне застосування та використовуються у одному випадку для визначення вінборону у товарному продукті, а в іншому випадку для посередньої індикації КІЛЬКОСТІ вінборону у бюпробі Ці методи аналізу вінборону не можуть бути застосовані для КІЛЬКІСНОГО визначення препарату у сироватці крові, що необхідно для вивчення фармакокінетики лікарської речовини при використанні різних лікарських форм і розробки оптимальних форм дозування Неможливість застосування раніше опублікованих методів визначення вінборону пов'язана з тим, що одни методи мають низьку чутливість аналітичної реакції (близько 10мкг/мл), у інших методах заважає визначенню ендогенні компоненти сироватки крові У випадку радювуглецевого методу визначення, неможливість врахувати метаболізм вінборону та ІЗОТОПНІ ефекти, які відмічалися для ізотопно-позначених речовин, наприклад кофеїну [6] концентрованій сірчаній кислоті О (О ю о (О Задана винаходу являється підвищення чутливості та специфічності методу визначення вінборону, тобто забезпечити можливість визначення препарату у сироватці крові Поставлена задача вирішує виділенням препарату із сироватки крові, методом екстракції органічним розчинником з іонним асоціатом, очистка отри манного екстракту методом тонкошарової хроматографії та обробки реагентом з послідуючим фотометруванням забарвленного розчину Основа способу визначення вінборону у сироватці крові становить у слідуючому до проби (сироватка крові) додавали трихлороцетову кислоту та бромфеноловий синій, отриманную субстанцію екстрагували бензолом, після чого органічний шар ВІДДІЛЯЛИ та випаровували розчинник до мікрооб'єму, який потім наносили на раніше підготовлену хроматографічну пластину, використовуючи сорбент силікагель марки L 5 / 40 Хроматографування проводили у системі 46056 розчинників бензол-метанол-піридин, після чого хроматограму підсушували та проявляли у УФСВІТЛІ у вигляді оранжевої плями Вінборон з хроматограми елюювали у розчин пдиметиламінобензальдепду в концентрованій сірчаній кислоті і нагрівали до завершення аналітичної реакції По інтенсивності утвореного рожевого забарвлення визначали КІЛЬКІСТЬ вінборону у пробі Для досягнення оптимальної специфічності та чутливості методу аналізу, був визначено максимум світлопоглинання продуктів реакції вінборону з розчином пдиметиламінобензальдепдом у сірчаній кислоті (Таблиця 1) Із отриманих результатів таблиці і бачимо, що максимум світлопоглинання продуктів реакції вінборону з розчином пдиметиламінобензальдепду у концентрованій сірчаній кислоті досягав при довжині хвилі 530 550нм Таблиця 1 Визначення максимума поглинання продуктів реакції вінборону з п-диметиламінобензальдепдом у сірчаній кислоті Довжина хвилі Довжина хвилі Довжина хвилі Оптична густина Оптична густина Оптична густина нм нм нм 380 0,215 496 0,580 612 0,432 384 0,212 600 0,602 616 0,400 388 0,204 504 0,620 620 0,368 392 0,192 508 0,630 624 0,343 396 0,179 512 0,840 628 0,309 400 0,164 516 0,655 632 0,281 404 0,155 620 0,660 636 0,254 408 0,147 524 0,670 640 0,232 412 0,146 528 0,675 644 0,207 416 0,150 532 0,680 648 0,186 420 0,180 536 0,681 652 0,168 424 0,169 540 0,685 656 0,149 428 0,182 544 0,690 660 0,134 432 0,196 548 0,690 664 0,123 436 0,215 552 0,890 668 0,112 440 0,240 556 0,690 672 0,100 444 0,260 560 0,685 676 0,095 448 0,285 564 0,678 680 0,089 452 0,310 568 0,670 684 0,087 456 0,334 572 0,660 688 0,082 460 0,361 576 0,545 692 0,080 464 0,385 580 0,630 696 0,077 468 0,416 584 0,610 700 0,074 472 0,441 588 0,592 704 0,071 476 0,468 592 0,570 708 0,070 480 0,495 596 0,548 712 0,067 484 0,518 600 0,522 716 0,085 488 0,538 604 0,502 720 0,063 492 0,560 608 0,464 724 0,060 Примітка - проба вміщувала 24мкг він борону - об'єм проби 2мл - довжина оптичного шляху 1см - оптична густина вимірювалась відносно контролю, де замість проби додавали дистильовану воду 5 46056 Надалі було вивчено залежність оптичної сірчанои кислоті, отриманий результати показані у густини продуктів реакції вінборону від таблиці 2 концентрації п-диметиламінобензальдепду у Таблиця 2 Залежність оптичної густини продуктів реакції вінборону від концентрації п-диметиламінобензальдепду у концентрованій сірчаній кислоті С n-ДМАВА мг/мл 0,01 0,05 0,10 0,50 1,0 2,0 5,0 10,0 Дп-Дк 0,010 0,014 0,014 0,070 0,070 0,190 0,244 0,260 Примітка - проба вмішувала 20мкг вінборону - фотометруемий об'єм 2мл - довжина хвилі 540нм - довжина оптичного шляху 0,5см Таким чином із таблиці 2 бачимо, що при визначенні вінборону КІЛЬКІСТЬ забавленних продуктів реакції збільшується при підвищенні концентрації п-диметиламінобензальдепду у сірчаній кислоті та стає приблизно постійною при досягненні концентрації пдиметидамінобензальдепду 2 - 10мг у одному мл сірчаної кислоти Для КІЛЬКІСНОГО визначення вінборону у фотометруємому зразку був побудован градуїровальний графік залежності оптичної густини від концентрації вінборону у пробі Отриманні результати наведені у таблиці З Таблиця З Градуїровальний графік залежності оптичної густини від концентрації вінборону у пробі Концентрація вінборону у пробі, С мкг Дп-Дк 2,0 0,027 4,0 0,050 6,0 0,079 8,0 0,102 10,0 0,142 12,0 0,170 14,0 0,197 16,0 0,224 18,0 0,268 20,0 0,275 24,0 0,342 28,0 0,381 32,0 0,430 36,0 0,500 40,0 0,560 Примітка - для побудови градуїровального графіку використали 0,5% розчин пдиметиламінобензальдепду у сірчаній кислоті - проби фотометрувади при довжині хвилі 540нм у кюветі з довжиною оптичного шляху 0,5см Як бачимо із результатів таблиці 3, мінімальне детектуємий рівень вінборону у пробі становить 2мкг, при цьому лінійна залежність оптичної густини від рівня препарату у пробі знаходиться у межах 2 - 40мкг Отриманий градуїровальний графік описується рівнянням лінійної регресії У(С) = (72,78 ± 2,575)Д, мкг Коефіцієнт молярного поглинання продуктів реакції вінборону з пдиметиламінобензальдегдом дорівнював Е540 1 86хЮ4 Відтворюванність пропонуємої аналітичної реакції визначення вінборону була вивчена при паралельному дослідженні восьми проб Отриманні результати відображені у таблиці 4 Таблиця 4 Відтворюванність метода визначення вінборону за реакцією з п-диметиламінобензальдепдом КІЛЬКІСТЬ вінборону у Статистичні Дп-Дк пробі, мкг параметри 20,6 0,250 20,0 0,250 Х = 0,249 20,0 0,252 m = ± 0,00275 20,0 0,250 S x = 0,004243 20,0 0,249 V = 1,10% 20,0 0,257 20,0 0,248 20,0 0, 242 Примітка X - середнє арифметичне восьми визначень він борону m - абсолютна похибка середнього арифметичного Sx - середня квадратична похибка середнього арифметичного V - коефіцієнт варіації Як бачимо із результатів наданих у таблиці 4, пропонуемий спосіб визначення вінборону відтворюється з середнім коефіцієнтом варіації 1,10% при паралельному аналізі восьми проб Пряме визначення вінборону у сироватці крові було неможливим, тому що сироватка крові вмішує речовини, котрі обуглюються у концентрованій сірчаній кислоті, що значно знижує чутливість методу визначення У зв'язку з цим був застосований метод виділення вінборону із сироватки крові, методом екстракції бензолам з іонною парою У якості іонної пари використовували 0,1% розчин бромфенолового синього Умови та результати проведення екстракції відображені у таблиці 5 46056 Таблиця 5 Хараісгеристика способу екстракції вінборону із сироватки крові КІЛЬКІСТЬ Додано вінборону до сироватки, мкг Визначено вінборону у сироватки, мкг % естракцм Об'єм сироватки аналіз мл Об'єм бензолу на аналіз, мл бромфенолового синього мг 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 16,00 16,84 16,42 14,00 15, 16 80,0 84,2 82,1 70,0 75,8 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 10,0 10,0 10,0 13,0 10,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 20% ІХУ мл 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Примітка - проби екстрагували на протязі 5 хвилин у колбі з герметичною пробкою Із таблиці 5 Бачимо, що у наведених умовах вінборон екстрагується у средньому на 78,42 ± 4,416 ВІДСОТКІВ У зв'язку з тим, що препарат екстрагували із сироватки бензолом іонною параю з бромфеноловим синім, для виділення вінборону застосували очистку екстракту тонкошаровою хроматографією на скляних хроматографічних пластинах на поверхні селікагелю марки L 5 / 40 фірми "Lachema" м Брно, використовуй у якості рухомої фази суміш розчинників бензол-метанолпіридин При цьому бромфеноловий синій зупинявся на лінії старту, а препарат підіймався сумісно з рухомою фазою Отриманні результати надані у таблиці 6 Таблиця 6 Виділення вінборону із екстракту сироватки методом тонко-шарової хроматографі бензол мл 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 Рухома фаза метанол піридин мл мл 1,0 1,0 0,6 і,0 0,5 і,0 1,0 0,5 1,0 0,5 1,0 0,5 Коефіцієнт утримання Rf Площа плями на хроматограмі мм Концентрація вінборону у пробі, мкл 0,83 0,63 0,60 0,65 0,53 052 168 300 256 361 5,0 5,0 5,0 10,0 15,0 20,0 Примітка - хроматограму проявляли флуоресцюючої плями у УФ-СВІТЛІ, Таким чином із отриманню результатів таблиці Є бачимо, що у системі розчинників бензол-метанол-піридин (співвідношення 7 1 0,5 за об'ємом) вінборон виділявся з коефіцієнтом утримання Rf 0,58 Для отримання КІЛЬКІСНИХ результатів препарат елюїровали з хроматографічної пластини та проводили аналітичне визначення як було описано раніше по реакції з п-диметиламінобензальдепдом у концентрованими сірчаній кислоті Слід ВІДМІТИТИ, що після проведення хроматографування, пластину потрібно щільно просушить при 120°С на протязі ЗО хвилин, тому що залишкові КІЛЬКОСТІ на сорбенті рухомої фази заважають визначенню вінборону Приклад виконання аналізу Реактиви 1) п-диметижамівобенаадьдепд 2) сірчана кислота 3) бромфеноловий синій 4) бензол 5) силікагель марки L 5 / 40 "Laohema" 6) трихлороцтова кислота 7) метанол 8) піридин Виконання аналізу вінборон знаходили у вигляді оранжевої До одної частини (1 мл) сироватки крові додають 0,2 частини (0,2мл) 20% розчину трихлороцтової кислоти, десять частин бензолу (1 Омл) та одну частину (1 мл) 0,1 % розчину бромфенолового синього Пробу екстрагують у колбі з герметичною пробкою протягом хвилин, після чого екстракт центрифугували 10 хвилин при 3000 1/кв Сухою піпеткою ВІДДІЛЯЛИ органічну фазу у широкі пробірки і випаровували на ПІСОЧНІЙ бані до об'єму приблизно 0,5мл Сконцентрований екстракт наносили на попередньо підготовлену хроматографічну пластину Пробірку промивали 0,2мл бензолу, який також наносили на хроматографічну пластину Після нанесення проби на ЛІНІЮ старту, проводили хроматографування у системі розчинників бензол-метанол-піридин (співвідношення 7 1 0,5 за об'ємом) у вертикальному апараті для хроматографування Після під'єму фронту рухомої фази на 15см, хроматографічну пластину виймали та щільно висушували при 120°С у термостаті Потім хроматограму проявляли у ультрафіолетовому СВІТЛІ Вінборон проявлявся у вигляді оранжевої 46056 флуоресцюючої плями з коефіцієнтом утримання Rf 0,58 Ідентифікацію препарату проводили по свідку, який наносили на хроматографічну пластину навколо проби Потім відмічену тонким шпателем пляму счищали з хроматографічної пластини сумісно з сорбентом у суху і чисту пробірку До, проби вінборону з сорбентом у пробірці додавали дві частки (2мл) свіжезробленого 0,5% розчину п-диметиламінобензальдепду у концентрованій сірчаній кислоті та нагрівали 10 10 хвилин на водяній бані при температурі 85°С Після охолодження, пробірки центрифугували при 3000 1/хв на протязі З О хвилин для відділення осаду сорбенту та проводили фотометрування забарвлений у червоне-фюлетовий колір розчин при довжині хвилі 540нм, у кюветі з довжиною оптичного шляху 0,5см КІЛЬКІСТЬ вінборону у пробі визначали по градуїровальному графіку побудованому на стандартних розчинах вінборону ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71