Спосіб доопераційної диференційної діагностики доброякісних та злоякісних новоутворень щитовидної залози

Винахід стосується медицини, а саме ендокринології, і може застосовуватись для доопераційної диференційної діагностики доброякісних та злоякісних новоутворень щитовидної залози. Відомий спосіб доопераційної діагностики злоякісних новоутворень щитовидної залози - цитологічний, що полягає у дослідженні морфологічних ознак клітин, отриманих з пунктатів щи товидної залози [S.R. Kini Guides to Clinical Aspiration Biopsy. Thyroid., IGAKU-SHOI, NY - Tokyo. 1987]. Недоліком цитологічного методу є те, що він базується на визначенні непрямих, або вторинних ознак малігнізації клітин щитовидної залози і є недостатньо ефективним у ряді випадків. За прототип взятий імуноцитохімічний спосіб доопераційної діагностики злоякісних новоутворень щитовидної залози. Для цього на висушених нефіксованих мазках пункційного матеріалу за допомогою моноклональних антитіл непрямим імунопероксидазним методом проводять виявлення йодпероксидази. Цей фермент міститься в нормальних клітинах фолікулярного епітелію, але зникає в значному відсотку епітеліальних клітин раку щитовидної залози [Jean-Francois Henry, M.D. Th yroperoxidase immunodetection for the diagnosis of malignancy on fine-needle aspiration of thyroid nodules. World J. Surg. 18, 529-534, 1994]. Однак цей метод також має недоліки: а) за допомогою антитіл виявляють лише наявність детермінант йодпероксидази, а не Її активність. Але ж проведені раніше біохімічні дослідження свідчать про зменшення (часто до 0) саме активності йодпероксидази в злоякісних новоутвореннях щи товидної залози, а не зникнення самого ферменту; б) моноклональні антитіла є дуже дорогими за вартістю, для проведення серії імуноцитохімічних реакцій необхідна затрата часу (4-6 годин). В основу винаходу поставлена задача розробити простий у виконанні, оперативний та точний спосіб доопераційної диференційної діагностики доброякісних та злоякісних новоутворень щитовидної залози шляхом визначення активності йодпероксидази. Поставлена задача досягається тим, що в способі, який включає отримання пунктату щитовидної залози та виявлення ферменту йодпероксидази в клітинах фолікулярного епітелію, згідно з винаходом, за цитохімічним адаптованим бензидиновим методом виявляють активність йодпероксидази в клітинах фолікулярного епітелію, і при наявності йодпероксидазної активності в усіх клітинах пластів тиреоїдного епітелію, встановлюють доброякісний характер новоутворення, а при відсутності - злоякісний. Основною відмінністю вказаного способу доопераційної діагностики новоутворень щитовидної залози від прототипу є те, що автори вперше пропонують з метою диференційної діагностики доброякісних та злоякісних новоутворень щитовидної залози, використовувати виявлення йодпероксидазної активності в епітеліальних клітинах щитовидної залози пунктатів за цитохімічним адаптованим бензидиновим методом. Даний спосіб цитохімічного визначення йодпероксидази в пунктатах щи товидної залози є більш оперативним (займає 15-20 хвилин), простим за виконанням та дешевшим, ніж імуноцитохімічний, поскільки не потребує використання дорогих за вартістю антитіл та затрати часу. Цей метод дозволяє виявляти в епітелії пунктатів саме активність йодпероксидази на відміну від імуноцитохімічного методу, коли за допомогою антитіл виявляють наявність лише детермінант цього ферменту. Це є важливим, оскільки проведені раніше біохімічні дослідження свідчать про зменшення (в більшості випадків до повного зникнення) в клітинах раку щитовидної залози саме активності йодперксидази, а не зникнення цього ферменту. Спосіб здійснюється таким чином. Матеріал, отриманий з новоутворень щитовидної залози за допомогою тонкогольчатої аспіраційної пункційної біопсії, досліджують під мікроскопом та відбирають пунктат, який містить багато епітеліальних пластів. Пунктат фарбують за адаптованим цитохімічним бензидиновим методом. Для цього на пунктат наносять буфер ТРИС-HCL (рН=6,0-6,15) протягом 15-20 секунд. Після цього препарати оброблюють 1% розчином NH4Mo в 0,9% NaCl протягом 5-8 хвилин. Потім наносять інкубаційну суміш наступного складу: 0,1мкг бензидину розчинити в 10мкл ацетону або диметіл-формамиду, додати 1,5мл буфер у ТРИС-HCL, 10мкл 5% розчину Трилону Б(ЕДТА), 10мкл насиченого розчину NH4CL, 1,9мкл 6% Н2О2. Через 10-15 хвилин пунктат промивають дистильованою водою. Після висушування пунктат досліджують морфологічно під мікроскопом. Цитоплазма клітин, які містять йодпероксидазну активність, фарбується у вигляді яскравих синьо-зелених гранул. Оцінюється реакція у пластах епітеліальних клітин. Якщо всі епітеліальні клітини пластів мають позитивну йодпероксидазну реакцію, то встановлюють діагноз доброякісного новоутворення щитовидної залози, а якщо йодпероксидазна активність не виявляється в епітелії пунктату - встановлюють злоякісний характер новоутворення. Наведемо кілька прикладів використання даного способу в нашій діагностичній цитологічній практиці. 1. У пацієнтки Мороченець Н.М., 1978 року народження, при ультрасонографії було знайдено новоутворення правої долі щитовидної залози розміром 15мм. Проведена тонкогольчата аспіраційна пункційна біопсія новоутворення, після чого пунктати зафіксовані, пофарбовані за стандартним методом MGG, та досліджені морфологічно. Епітеліальні клітини новоутворення були підозрілими на злоякісні, але не мали певних ознак малігнізації. В пунктаті знайдені підозрілі мікрофолікулярні структури, але внутрішньоядерних включень не було. В одному з пунктатів, на якому при нативному дослідженні під мікроскопом, виявлялося багато епітеліальних клітин, цитохімічно виявлялася йодпероксидаза за запропонованим нами методом. Після проведення реакції не було знайдено жодної епітеліальної клітини, яка б мала йодпероксидазну активність. Це дозволило вважати новоутворення злоякісним. Гістологічно був поставлений діагноз фолікулярної карциноми, що підтвердило злоякісність новоутворення. 2. Пацієнт Філіпов В.Г., 1968 року народження. В отриманих пунктатах новоутворення щитовидної залози, епітеліальні клітини мали ознаки виразної атипії, але недостатні для встановлення діагнозу карциноми (відсутні цитоплазматичні включення у ядра). В той же час в пунктаті не була виявлена активність тиреоідної пероксидази. Це дало можливість вважати новоутворення злоякісним. Післяопераційний гістологічний діагноз підтвердив злоякісність новоутворення. 3. У пацієнта Сушинського В.Ю 1975 року народження в пунктатах новоутворення були знайдені морфологічні ознаки аденоми щитовидної залози, але цитолога турбувала виразна проліферація, поліморфізм та певна атипія епітелію, що не виключало фолікулярної карциноми. На одному з пунктатів була проведена реакція виявлення йодпероксидази. Усі епітеліальні клітини пунктату демонстрували виразну йодпероксидазну активність. Це дозволило нам поставити цитологічний діагноз - аденома щитовидної залози. Гістологічно була виявлена фолікулярна аденома щитовидної залози, що підтвердило наш діагноз. Діагностичні можливості методу доведено шляхом порівняння отриманих цим способом доопераційних діагнозів з гістологічними заключениями у 50 пацієнтів. Всі пацієнти (15), в пунктата х яких всі клітини пластів тиреоїдного епітелію мали йодпероксидазну активність, після операції мали гістологічний діагноз доброякісного новоутворення (аденоми або аденоматозного вузла). У 18 пацієнтів, пунктати яких не мали жодної епітеліальної клітини з йодпероксидазною активністю та 12 пацієнтів, в пунктатах яких зустрічалися такі поодинокі клітини, був поставлений гістологічний діагноз карциноми. Таким чином, спосіб придатний для використання в цитологічних діагностичних лабораторіях.