Спосіб одержання концентрованого цільновіріонного преципітувального антигену вірусу хвороби марека

Спосіб одержання концентрованого цільновіріонного преципітувального антигену вірусу хвороби Марека, що включає подвійне заморожування та відтавання антигенної маси, який відрізняється тим, що після відтавання клітинний детрит видаляють центрифугуванням, дезінтегрують ультразвуком, концентрують на колонках у загальному об'ємі вірусовмісного супернатанту та преципітують додаванням 22% ПЕГ-6000. Корисна модель відноситься до ветеринарної вірусології та біотехнологїі, зокрема, до способів виготовлення діагностичних антигенів для виявлення антитіл до вірусу хвороби Марека (ВХМ) та гі пері му н Іза ції тварин при виготовленні специфічних анти сироваток до цього збудника. Хвороба Марека (ХМ) - переважно хронічне лімфопроліферативне захворювання сільськогосподарської та дикої птиці, що супроводжується нервовими явищами і утворенням локальних та гене рал ізова них Т-лімфом в органах грудочеревної порожнини, шкірі та іноді м'язах. Діагностика ХМ базується на використанні патоморфологічних методів розтину та виготовлення гістологічних препаратів уражених імунокомпетентних органів Імунний статус птиці визначають за допомогою різноманітних способів, в тому числі за реакцією дифузійної преципітації (РДП) [Сюрин В.Н., 1991, 1998]. Цей метод застосовують при з'ясуванні рівнів материнських антитіл у жовтковому мішку курячих ембріонів (КЕ), в жовтку інкубаційного яйця, в сироватках крові птиці. Антигени для РДП одержують за різноманітними способами, в тому числі висолюванням сульфатом амонію, діалізом проти градієнту гіпертонічних розчинів тощо. При виготовленні діагностичного антигену ВХМ концентрують клітини інфіковані збудником до концентрації 1*107/см3 Далі їх піддають дворазовому заморожуванню та відтаюванню, після чого суспензію використовують, як антиген в РДП [Bulletin of О.I.E., 2002]. Це рішення може бути прототипом способу одержання концентрованого цільновІріонного преципітувального антигену ВХМ. Недоліком прототипу є втрата значної кількості віріонів, що знаходились у культу рал ьному середовищі. Крім того, наявність у масі антигену уламків клітин може викликати появу неспецифічних реакцій при імунодифузії Також відомо, що велика кількість віріонів, зв'язавшись з клітинним детритом, втрачає можливість дифузії в товщині агарового покриття. Ці фактори знижують активність такого антигену. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб одержання концентрованого цільновІріонного преципітувального антигену ВХМ шляхом використання видаленого центрифугуванням детриту, його ультразвукової дезінтеграції, і подальшого концентрування вірусовміщуючого супернатанту на колонках та преципітування 22% ПЕГ-6000. Спосіб виконується таким чином. Спочатку накопичується клітинна біомаса фібробластів КЕ шляхом трипсинізації 11-12-ти добових КЕ. Клітини після підрахунку висівають в концентрації' 500000 клітин/см культу раль ного середовища Для вирощування моно шарової культури використовують середовища 199 та ІГЛА в рівних об'ємах з додаванням 10% сироватки крові великої рогатої худоби (ВРХ). Після 24-36 годин інкубації, при температурі 37°С сформовану моношарову культуру інфікують вірусами герпесу індиків (ВГІ), III cepoтип або герпесу курей (ВГК), II серотип у дозі 25000 ФУО/матрас об'ємом 1500 см 3 Після іноку со 7198 ляції вірусу в матраси вносять по 200 см підтримуючого середовища 199 та ІГЛА в рівних об'ємах без сироватки ВРХ. Матраси з інфікованою культурою інкубують в термостаті протягом 5-6-ти діб. Далі їх переносять до морозильної камери на б годин при температурі -20°С, а після заморожування відтаюють на водяній бані при температурі 30°С. Процедуру заморожування-відтаювання повторюють двічі. Далі центрифугують при 5000 обертів/хвилину впродовж 15 хвилин для видалення клітинного детриту. Супернатант збирають в окремому посуді, а детритний осад піддають дезинтеграції на ультразвуковому апараті УЗДН2Т з частотою 22kHz 10 хвилин Дезінтегровану суспензію знов центрифугують, а надосад добавляють до загальної маси антигенної сировини (супернатанту). На наступному етапі здійснюють концентрування сировини на колонці АР-02-15-ПА (проникність колонкових волокон 15кДа) в 50 разів. До одержаного концентрату додають 22% ПЕГ-6000. Після цього ПЕГ-антигенну суміш переносять в холодильник (температура 4°С) на 18 годин. Після утворення ПЕГ-білкового преципітату надосад обережно зливають та піддають центрифугуванню при 5000 обертів/хвилину протягом 5 хвилин. Отриманий сукупний об'єм осаду ресуспендують фосфатно-буферною сумішшю Веренсена у співвідношенні 1:1. До загального об'єму отриманого концентрату додають розчин мертіоляту до кінцевої концентрації' 1:10000 та перемішують до утворення гомогенної маси скляною паличкою. Ефективність даного способу розкривається в прикладах. Приклад 1. Отриманий антиген та антиген, одержаний за методом-прототипом, використовували для постановки реакції' дифузійної преципітації (РДП) Для з'ясування специфічності та активності антигену брали гіперімунні поліклональні сироватки від курей, щеплених ВХМ. Розведення антигенів готували з кроком 2 від 1:2 до 1:4096. Як контрольний позитивний антиген нами використаний антиген із штаму вірусу герпесу курей SBG у розведенні 1:64, зконцентрований методом діалізу проти градієнту 50% розчину ПЕГ-6000, а як нега Комп'ютерна верстка А. Крулевський тивний контрольний антиген - суспензію інтактної культури фібробластів КЕ, отриману за аналогічним способом. РДП ставили на предметному склі в гелі, виготовленому з агаро-сольової суміші за прописом ІЕКВМ УААН. Компоненти вносили в лунки в дозі 0,35 см 3 Після 24-годинної експозиції при температурі 37°С позитивні смуги преципітації виявлені в агарі на склі, де вносили антиген, отриманий за способом-прототипом, в розведеннях до 1:64. В агарі на склі, де вносили антиген, отриманий за нашим способом позитивна реакція у вигляді чітких смуг спостерігалась в розведеннях до 1:512. Негативний контроль не давав специфічних смуг преципітації. Приклад 2. Як досліджуваний компонент використані екстракти жовтків інкубаційного яйця від гіперімунізованих курей та невакцинованих курей з приватного благополучного по ХМ господарства. Екстракти отримано за методом Veiera R (1982). Для цього 10 см 3 жовтку розводили 1:1 фосфатним буфером з рН 5,6 та додавали 5% за об'ємом 10%-го розчину хлориду магнію. Утворений преципітат делюювали до 10 см 3 та досліджували в РДП. Як позитивний та негативний використані антигени, описані в прикладі 1. Отриманий за запропонованим способом антиген було використано в розведенні 1:128, а антиген, виготовлений за способом-прототипом, - в розведенні 1:16. При дослідженні з антигеном, отриманим за способом, що пропонується смуги преципітації відмічали при розведеннях екстракту жовтків яєць гіперімунної птиці до 1:256-1'1024. Антиген, отриманий за способом прототипом утворював преципітувальний комплекс з розведенням жовтків яєць гіперімунної птиці до розведення 1:512. З екстрактами жовтків інтактних курей смуги преципітації не утворювались. Отриманий за описаним способом антиген мас високу активність і специфічність у порівнянні зі способом-прототипом. Його використання дозволяє проводити індикацію та визначення титрів преципітувальних антитіл до вірусу хвороби Марека в сироватці крові курчат та жовтку інкубаційного яйця. Він має низьку собівартість та забезпечує експресність постановки діагнозу. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м Київ - 42, 01601