Спосіб лабораторної діагностики лайм-бореліозу

Винахід відноситься до галузі медицини, а саме імунології і стосується лабораторної діагностики інфекцій, викликаних Borrelia burgdorferi. Аналіз ситуації, прогнозування захворюваності, здійснення епідеміологічного нагляду при хворобі Лайма (ХЛ) може здійснюватись лише за умови організації її лабораторної діагностики в лабораторіях обласних (районних) профілактично-лікувальних закладів, що неможливо без існування дешевих і технічно простих методів. В Україні, як і в багатьох межуючих з нею країнах, основним методом діагностики є непряма реакція імунофлюоресценції (НРІФ) [1], яка завдяки відносній простоті і невеликій собівартості в найближчі роки залишиться у нас, мабуть, найбільш розповсюдженою. В той же час проведення НРІФ потребує відсутнього у районних і ряді обласних медичних закладів люмінесцентного мікроскопу. Тому збільшення об'єму лабораторних досліджень на ХЛ безпосередньо залежить від наявності лабораторного тесту те хнічно більш доступного ніж НРІФ. У зв'язку з цим особливу увагу привертає імунопероксидазна реакція (ІПР), що досить широко застосовується як метод лабораторної діагностики вірусних, рикетсійних, паразитарних захворювань шляхом прямого виявлення збудників в біологічних пробах імуноферментним аналізом (ІФА) [2,3,4,5]. Те хнічні особливості цього методу полягають в тому, що результати реакції читаються за допомогою звичайного світлового мікроскопу (без спеціальних насадок) і тому цей метод має суттєві переваги перед НРІФ в простоті і економічності. В основу винаходу поставлено розробку на базі реакцій ІПР та НРІФ нового ефективного та доступного способу серологічної діагностики хвороби Лайма у людей. Дане завдання досягається шляхом виявлення антитіл до Borrelia burgdorferi в сироватці крові хворих, який відрізняється тим, що розроблений на основі імунопероксидазної реакції (ІПР) з використанням в якості антигену корпускулярного бореліозного антигену зі штаму Ip-21 Borrelia afzelii, а в якості кон'югату – антитіл до людського імуноглобуліну, мічених пероксидазою хрону. Перша стадія розробки включала експериментальне визначення можливості використання при при імунопероксидазній реакції бореліозного антигену, розробленого для НРІФ в лабораторії екології переносників НДІЕМ ім. Н.Ф. Гамалеї АМН РФ. (м. Москва) та підбір оптимальних термінів інквубації препаратів (комплексу антиген-антитіло) з кон'югатом виробництва підприємства бакпрепаратів при НДІЕМ ім. Н.Ф. Гамалеї АМН РФ. Дія кон'югату на препарат вивчалась у чотирьох часових інтервалах: 40 хв., 1 год., 1,5 год., 2 год. Оптимальним терміном обробки препарату виявився 1,5 год. Постановка реакції. 1. На предметні скла наносили корпускулярний бореліозний антиген із розрахунку по 1 краплі (0,02мл) на 1 досліджувану пробу (сироватку). Висушували на повітрі при кімнатній температурі протягом 12 год. 2. На висушений антиген наносили по 0,02мл досліджуваної сироватки (проби) у відповідних розведеннях. Препарати поміщали у вологу камеру і інкубували при 37°С в термостаті протягом 40-50 хв. 3. Препарати промивали тричі по 10 хв. у фосфатно-буферному розчині (ФБР) і один раз протягом 5 хв. у дистильованій воді, після чого висушували на повітрі. 4. Наносили на препарати таку ж кількість (0,02мл) кон'югату в робочому розведенні (антитіла проти глобулінів людини, мічені пероксидазою хрону). Інкубували при 37°С 40-50 хв., промивали та висушували вище вказаним способом (п. 3) протягом. 1,5 год. 5. Для виявлення пероксидази на висушені препарати наносили по краплі (0,02мл) бензидинового індикатору (діамінбензидин)*. 6. Через 5-10 хв. препарати промивали в ФБР, висушували. 7. Переглядали препарати під звичайним мікроскопом при збільшенні окуляру - х10, об'єктиву - х90 та тубусом х1,1. При позитивному результаті продукт реакції (комплекс антиген-антитіло) має коричнювате забарвлення. В другій стадії розробки проводили порівняльне визначення ефективності ІПР і НРІФ. Обстежували сироватки крові 132 хворих з Волинської, Запорізької, Донецької, і Херсонської областей: 53-х - з підозрою або попереднім діагнозом "хвороба Лайма" та 79-и - з гострими гарячковими захворюваннями. Терміни обстеження сироваток - 110 (18 і 28 хворих в 1-й і 2-й групах відповідно), 11-20 (19 і 33 хворих), 21-30 (16 і 18 хворих) днів від початку захворювання. Приклад 1. Чутливість методів визначали за кількістю позитивних результатів при дослідженні сироваток методами НРІФ і ІПР у гострому періоді захворювання на ХЛ (чутливість реакцій) (І група хворих - 53). Одержані при цьому результати свідчать про те, що ІПР "працює" не гірше, а на ранніх етапах захворювання на ХЛ - дещо краще ніж НРІФ. Кількість позитивних результатів при застосуванні ІПР перевищувала таку при НРІФ у вищезазначені терміни обстеження на 5,6, 5,3 і 6,2% відповідно (фіг. 1). Приклад 2. Специфічність обох реакцій визначали за кількістю ; від'ємних щодо ХЛ результатів серед хворих з гострими гарячковими ; захворюваннями (2 група - 79 хворих). Контрольне паралельне обстеження сироваток крові гарячкових хворих (гр упа 2) дало наступні результати: у НРІФ і ІПР кількість серонегативних результатів склала відповідно: 46,4 і 50,0% (1-10 днів), 39,4 і 39,4% (11-20 днів), 27,3 і 27,3 % (21-30 днів) (фіг.2). Таким чином, встановлені показники специфічності і чутливості ПІР і НРІФ у проведених дослідах практично ідентичні. Одержані дані свідчать, що ІПР відображує динаміку специфічної гуморальної відповіді протягом гострого періоду захворювання ХЛ. З огляду на. те, що за простотою і доступністю виконання ІПР має ряд економічних переваг перед класичними методами, запропонований спосіб діагностики може бути рекомендований для широкого застосування в клініко-діагностичній практиці при серологічних дослідженнях на ХЛ. Результатом розробки стало виявлення ефективності запропонованого способу діагностики Лайм-бореліозу та апробація можливості його застосування в умовах практичної діагностичної лабораторії. Перелік фігур: Фігура 1. Відсоток позитивних результатів при дослідженні сироваток методами НРІФ (позначені цифрою 1) і ІПР (позначені цифрою 2) у гострому періоді захворювання на ХЛ (чутливість реакцій) Фігура 2. Відсоток від'ємних результатів при дослідженні на ХЛ сироваток крові гарячкових хворих методами НРІФ (позначені цифрою 1) і ІПР (позначені цифрою 2) в гострому періоді захворювання) Джерела інформації: 1. Непрямая реакция иммунофлюоресценции в лабораторной диагностике иксодовых клещевых боррелиозов / Э.И. Коренберг, В.В. Николенко, Н.Н. Воробьева и др.// Мед. паразитол. - 2000. - № 1. - С. 9-15. 2. В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомин Диагностика вирусных болезней животных. - М. «Агропромиздат». - 1991. - 526 с. 3. А.П. Никонов, О.Р. Ацкатурова Генитальный герпес и беременность // Гинекология. - т. 4, № 1. - С.234-237. 4. Л.С. Щеголева, Л.К. Добродеева. Результаты исследований иммунологического статуса у человека в условиях севера // Иммунология. - 2003. - №3. - С. 177-181. 5. Р.А. Янковский Возможность диагностики и выявления инфекционных заболеваний // Медтехника и медизделия. - 2001. - № 4 (6). - С. 142-144.