Спосіб отримання життєздатних ембріональних плюрипотентних прогеніторних клітин за допомогою колагенази

Винахід відноситься до галузі медицини та біології і може бути використаним у технології створення препаратів для клітинної терапії. У теперішній час у клітинній трансплантології застосовуються способи виділення і кріоконсервації ембріональних клітин, які засновані на механічному роздрібленні тканин ембріону (гомогенізація) і фільтрації, що знижує вихід життєздатних клітин до 0,1-5,0-10/мл [Застосування трансплантації кріоконсервованих гемопоетичних клітин ембріональної печінки в комплексному лікуванні хворих на злоякісні новоутворення: Метод, рекомендації. Автори: Гриневич Ю.Я., Смикодуб O.L, Бендюг Г.Д. та ін. - Київ, 1999. - 9с. Лікування хворих з вперше виявленим інсулінозалежним цукровим діабетом гемопоетичними клітинами ембріональної печінки: Метод, рекомендації. Автори: Єфімов А.С., Смикодуб О.І., Новицька А.В. - Київ, 2000. - 16с. Лікування мієлотоксичного агранулоцитозу у хворих на гострий лейкоз гемопоетичними клітинами ембріональної печінки людини: Метод, рекомендації. Автори: Смикодуб О.І., Гайдукова СМ., Третяк Н.М., Снігир Н.В. - Київ, 2001. 12с. Лікування анемії у хворих на інсулінозалежний цукровий діабет гемопоетичними клітинами ембріональної печінки людини: Метод, рекомендації. Автори: Єфімов А.С., Смикодуб О.І., Новицька А.В. - Київ, 2002. - 16с]. Для підвищення кількості стовбурових клітин застосовують їх стимуляцію ростовими факторами і культивацію [US 5817773 A. Wilson E.L., Gabrilove J. Способ стимуляции, получения, культивирования и трансплантации стволовых клеток с помощью ростовых факторов фибробластов. - Изобретения стран мира. - 1999. -Вып.8, №19. -С.74], що може змінювати властивості клітин щодо диференціювання аж до пухлинної трансформації. Мета винаходу. Розробити методику виділення підвищеної кількості життєздатних ембріональних плюріпотентних прогеніторних клітин без застосування факторів, що стимулюють проліферацію. Поставлена мета досягається тим, що ембріональні плюріпотентні прогеніторні клітини виділяються шляхом біохімічної обробки сполучнотканинної строми органів ембріону колагеназою in situ та in vitro. Результати експериментальних досліджень. Дослідження виконані на білих щурах. Вагітну самку вводили в наркоз (натрію етамінал - 40мг на кг маси тіла). Після асептичної обробки операційного поля (96° етиловий спирт, йод) проводили серединну лапаротомію по linea alba. Строк вагітності самки - 18-19 днів. Правий (7 ембріонів) і лівий (7 ембріонів) роги матки розрізали ножицями вздовж. Між ембріонами роги матки послідовно перетискували затискувачами типу "москіт". Після розтину рогів матки і плідних оболонок ембріонів переносили у стерильні флакони з охолодженим до 4°С середовищем Хенкса з гентаміціном (кінцева концентрація - 0,001%). У печінку ембріонів через портальну систему вводили під тиском 0,5мл колагенолітичної суміші [20,0мл середовища Хенкса +50,0мкл 10% СаСl2 +10мг колагенази (Sigma) +44мг HEPES (Sigma)]. Через 30хв. після потрійної промивки у середовищі ДМЕМ печінку кожного ембріона роздрібняли за допомогою хірургічного очного пінцету в 2,0мл середовища Хенкса. Після центрифугування (1000об/хв - 30с) супернатант видаляли, осад відновлювали в 2,0мл колагенолітичного розчину [20,0мл середовища Хенкса +50,0мкл 10% СаСl2 +10мг колагенази (Sigma) +44мг HEPES (Sigma)]. Пробирки інкубували у водяному термостаті при 37,0°С впродовж 45хв. при постійному перемішуванні. Після центрифугування (1000об/хв. - 60с) осад відновлювали в 2,0мл середовища Хенкса. Інкубацію клітин печінки в колагенолітичному розчині проводили 3 рази, кожен раз перевіряючи кількість життєздатних клітин в камері Горяєва мікроскопічно при забарвленні клітин трипановим синім. Результати кількісної динаміки виділення життєздатних клітин за звичайною і запропонованою нами методикою (по 7 ембріонів у кожному дослідженні) свідчать, що одноразове застосування колагенази збільшує вихід життєздатних ембріональних плюріпотентних прогеніторних клітин печінки на 45%, дворазове - на 367%, триразове - на два порядки. Висновок. Результати дослідження засвідчують значне збільшення виходу життєздатних ембріональних плюріпотентних прогеніторних клітин печінки без застосування факторів стимуляції їх росту. Відповідність критерію "новизна" даного способу забезпечує те, що для виділення підвищеної кількості життєздатних ембріональних плюріпотентних прогеніторних клітин печінки застосовується не механічний, а біохімічний метод їх відокремлення від сполучнотканинної строми. Відповідність критерію "суттєві відмінності" даного способу забезпечує те, що на відміну від відомих раніше способів виділення ембріональних плюріпотентних прогеніторних клітин збільшення їх кількості і життєздатності досягається шляхом обробки сполучнотканинної строми печінки ембріону колагеназою in situ та in vitro. Відповідність даного винаходу критерію "позитивний ефект" забезпечується результатами експериментальних досліджень, які засвідчують збільшення виходу життєздатних ембріональних плюріпотентних прогеніторних клітин на два порядки.