Спосіб отримання біологічно активної речовини

Ця заявка є частковим продовженням заявки України на винахід №20041211004 від 31.12.2004p. і вміщує її зміст щодо об'єкту "Спосіб отримання біологічно активної речовини". Корисна модель відноситься до області косметології, фармації і медицини, зокрема, до способу отримання біологічно активної речовини. Відомий спосіб отримання біологічно активної речовини з людської плаценти, що включає механічне подрібнення і гомогенізацію плаценти, отримання водного екстракту і обробку екстракту за допомогою електролізу протягом 1-1,5 години [патент РФ №22119903, МПК7 А61К7/48, 2003р.]. У результаті отримують желеподібну масу. Недоліком цього відомого способу є використання дефіцитної сировини людської плаценти. Крім того, при електролізі водного екстракту плаценти відбувається хімічне розщеплення пептидів, що містяться в екстракті, і появі в суміші продуктів їх розпаду у вигляді окремих амінокислот і не нативних пептидів, внаслідок чого біологічна активність продукту різко падає. Відомий також спосіб отримання плацентарного протеїну, що включає отримання гомогенату тканини плаценти свині, центрифугування, хроматографування, елюювання пов'язаного білка, осадження елюату і повторне центрифугування, при цьому з хроматографій використовують афінну хроматографію на сефарозі з іммобілізованим конго-червоним носієм, елюювання проводять 1,0М розчином хлориду калію з доданням 5% гліцерину, осадження елюату здійснюють при 90%-вому насиченні сульфатом амонію, а після центрифугування осадок додатково піддають фракціюванню в 0,1М амоній-бікарбонатному буфері з подальшим збором фракцій, що містять цільовий продукт, і їх діалізом [патент РФ №2007417, МПК5 С07К3/02, 1994]. Цей спосіб дозволяє отримати специфічний плацентарний протеїн свині 2 (ППС-2), який є плаценто специфічним антигеном і може бути використаний як маклер для ранньої діагностики поросності свині, але не як біологічно активна речовина широкого спектра дії, що застосовується в косметології, фармації і медицині. Відомий спосіб отримання низькомолекулярної фракції з тканин плаценти свині заснований на отриманні низькомолекулярної фракції вагою не більше за 300-350 атомних одиниць за допомогою попереднього подрібнення тканини на кріомлині при температурі від мінус 80°С до мінус 120°С з подальшим кріосублімаційним фракціюванням при температурі від мінус 10°С до мінус 20°С у вакуумних камерах при тиску 0,1мм.рт.ст. і подальшої кріоконденсації на кріогенний панелі, що охолоджується рідким азотом [патент РФ № 2228759, MПK7A61K35/50, 05.20.2004.]. Недоліком цього способу є те, що продукт містить фракції, молекулярна маса яких не перевищує 300-350 атомних одиниць, оскільки більш важкі молекули неможливо витягнути методом низькотемпературної сублімації. Тобто в продукті відсутні біологічно активні речовини, наприклад, пептиді з молекулярною масою вище за 300-350 атомних одиниць, які, як відомо, володіють протизапальною дією, є регулювальниками обмінних процесів. Низька продуктивність способу і використання складних і кріогенних технологій, що дорого коштують, обумовлюють високу вартість кінцевого продукту, що також є серйозною перешкодою для промислового використання цього відомого способу. Відповідно, вказані вище недоліки відомого способу обмежують також можливості застосування біологічно активних плацентарних речовин в косметиці і фармакології. Задачею корисної моделі є створення нового способу отримання біологічно активної речовини з плаценти свині, який дозволить простим способом отримувати цінний продукт при невисокій вартості. Поставлена задача вирішується тим, що в способі отримання біологічно активної речовини, що включає механічне подрібнення і гомогенізацію плаценти свині, отримання водного екстракту гомогенізату і консервацію екстракту, водний екстракт гомогенізату отримують шляхом його розбавлення водою, водну суспензію гомогенізату знебарвлюють доданням до суспензії підкислювача, витримують при перемішуванні, потім відстоюють, декантирують, а консервацію здійснюють шляхом додання до супернатанту консерванту. Переважно водний екстракт гомогенізату отримують шляхом його розбавлення дистильованою водою в співвідношенні 0,8-1,2 масових частин води на 1 частину гомогенізату, водну суспензію гомогенізату знебарвлюють доданням до суспензії 0,006-0,007 масових частин лимонної кислоти, витримують протягом 70-110 хвилин при перемішуванні, потім відстоюють протягом 10-20 хвилин, декантують, консервацію здійснюють шляхом додання до супернатанту ніпагіну, супернатант з консервантом витримують протягом 45-75 хвилин, після чого з декантованого супернатанта видаляють частки з розмірами більше 3мкм шляхом фільтрації. Біологічно активна речовина, що отримана згідно з описаним вище способом, включає вільні амінокислоти, пептиди і низькомолекулярні органічні залишки, переважно при наступному співвідношенні компонентів, % сухої ваги: Вільні амінокислоти від 100 до 500 Д 21,6-26,6 Пептиди від 1000 до 2000 Д 35,3-43,1 Пептиди від 3000 до 5000 Д 16,5-20,1 Низькомолекулярні органічні залишки менше за 100 Д решта. Більш детально корисна модель описана за допомогою приведеного нижче прикладу. Приклад Розморожену і ретельно відмиту від крові тканину плаценти свині в кількості 10 кг очистили від слизу, подрібнили ножицями до часток розміром приблизно 50х50мм і гомогенізували за допомогою електром'ясорубки. Отриманий гомогенізат залили 10л охолодженої до 15°С дистильованою водою, ретельно перемісили до отримання однорідної суспензії і додали 70г лимонної кислоти для знебарвлення суспензії. Для екстракції водорозчинних пептидів суспензію плаценти витримали в ємності протягом 1,5 годин при повільному перемішуванні, після чого дали відстоятися протягом 15 хвилин. Біологічно-активно речовину у вигляді супернатанту в кількості 10л декантували і додали до нього 0,5кг розчину, який містить 20г ніпагіну (як консерванту), що розчинений в 0,5кг пропіленгліколю. Суспензію ретельно перемішали і витримали протягом 1 години. Отриманий водний екстракт плаценти відфільтровували за допомогою мембранних фільтрів типу "Миллипор" з діаметром пір 1-3мкм. Отримали 10 л чистого пептидного екстракту плаценти. Водний екстракт розлили по ємностях і вмістили на зберігання в морозильну камеру з температурою мінус 28°С. Отриманий водний екстракт плаценти є прозорою, злегка жовтуватою, рідиною з характерним слабким запахом, має рН від 3,8 до 4,5. Сухий залишок складає не менше за 6 і не більше за 7%. Отриманий водний екстракт плаценти досліджували з допомогою гель-проникаючої високоефективної рідинної хроматографії (ГПВЕРХ). За даними гель-хроматографії був визначений фракційний склад (по молекулярній масі) водного екстракту плаценти свині. Прилади і матеріали Для визначення фракційного складу водного екстракту плаценти використали рідинний хроматограф Woters "Alliense", з програмним забезпеченням Міленіум 32, версія 51. Умови аналізу: - колонка TSK SW 2000, розміром 7,5х600мм; - рухлива фаза: фосфатний буферний розчин з сульфатом натрію - ацетонітрил (90:10), дегазована будьяким зручним способом. - швидкість рухливої фази 1мл/хв.; - об'єм проби 20мкл. Приготування рухливої фази 32,21г натрію фосфорнокислого однозаміщеного двохводного вміщують в мірну колбу місткістю 1л, розчиняють в 500мл води, доводять об'єм водою до мітки і перемішують (розчин А). 71,64г натрію фосфорнокислого двохзаміщеного дванадцативодного вміщують в мірну колбу місткістю 1л, розчиняють в 500мл води, доводять об'єм водою до мітки і перемішують (розчин Б). 32,22г натрію сірчанокислого десятиводного вміщують в мірну колбу місткістю 1л, розчиняють в 300мл води, додають 312,5мл розчину А і 187,5мл розчину Б, перемішують, додають 100мл ацетонітрилу, перемішують і доводять об'єм розчину водою до мітки. Результати аналізу представлені в таблиці. Таблиця Фракційний склад (по молекулярній масі) водного екстракту плаценти за даними гель-хроматографії ( l = 254 нм) Час витримки речовин на колонці (хвилини) Площа під хроматограф, піком 18.576 20.062 20.479 2075501 2332345 2116487 21.569 2749469 Площа під Орієнтовна молекулярна маса, хроматограф. піком (в (дальтон) %) 18.29 3000