Спосіб одержання біологічно активної речовини з гепатопротекторними та гастроентерологічними властивостями

Винахід відноситься до мікробіологічної і медичної промисловості, до галузі біотехнології і стосується способів одержання біологічно активної речовини з гепатопротекторними і гастроентерологічними лікувальними властивостями. З давніх пір і в теперішній час для лікування гастроентерологічних захворювань (виразкової хвороби шлунку та дванадцятипалої кишки, гастритів) і захворювань печінки використовується велика кількість препаратів хімічного і біологічного походження, які представлені в основному засобами рослинного і тваринного походження. В останній час вважаються більш перспективними і розроблюються нові препарати з гепатопротекторними і гастроентерологічними властивостями мікробного походження. Це обумовлено широкою можливістю одержання нових препаратів за рахунок відбору штамів і штучного мутагенезу продуцентів для направленого біосинтезу. Відомі способи одержання препаратів на основі живих клітин мікроорганізмів-симбіонтів природньої мікрофлори шлунково-кишкового тракту ссавців (пробіотики, нормофлори). Препарати біфідумбактерін, колібактерін, бактилсубтін, лактобактерін проявляють антагоністичну дію на патогенні мікроорганізми і застосовуються при різних шлунково-кишкових захворюваннях (Машковский М.Д. „Лекарственные средства”, справочник, М., Медицина. 1993). Проте, при одержанні цих препаратів приходиться вирішувати основні проблеми - збереження життєздатності клітин в процесах впровадження, консервації, зберігання і реактивації, які ускладнюють і роблять дорожчою технологію виготовлення вказаних препаратів. Увагу дослідників давно приваблюють штами мікроорганізму Lactobacil-lus bulgaricus, які відомі своїм сприятливим впливом на організм ссавців. Так, відомий спосіб одержання гастроентерологічного і біостимулюючого засобу шляхом гомогенізації нативних клітин Lactobacillus bulgaricus, пектину та бджолиного молочка (а.с. Болгарії № 46478, 1990 р.). Даний спосіб пропонує введення таких дороговартісних і дефіцитних компонентів, як пектин і бджолине молочко. Відомий також спосіб одержання лікарського засобу шляхом культивування лактобацил на білковому середовищі з подальшим висушуванням цільового продукту. Останній препарат має тільки симптоматичну дію. Найбільш близьким (прототипом) до заявленого є спосіб одержання біоактивного засобу для профілактики і лікування шлунково-кишкових захворювань шляхом культивування Lactobacilms bulgaricus на соєвому середовищі в анаеробних умовах з подальшим висушуванням біомаси і виготовленням лікарської форми (а.с. Болгарії,№ 38806, 1986 р.). Препарат ефективний тільки при лікуванні гастриту і виразкової хвороби шлунку. Задача, яку вирішують автори запропонованого способу, складається з розробки промислового способу одержання біологічного активної речовини з гастроентерологічними властивостями з додатковими терапевтичними функціями (стимулюючий ефект по відношенню до біоелектричної активності шлунку і тонкого кишечника, сприятливий вплив на травну функцію шлунково-кишкового тракту), а також з гепатопротекторними властивостями (лікування захворювань печінки), без токсичного ефекту. Поставлена задача вирішується способом одержання біологічно активної речовини (БАР) з гепатопротекторними і гастроентерологічними властивостями шляхом культивування мікроорганізму Lactobacillus bulgaricus з подальшим виділенням і сушкою біологічно активної речовини, який відрізняється тим, що в якості культури-продуцента використовують штам Lactobacillus delbrueckii sp. bulgaricus 9702, депонований в колекції Депозитарію Інституту мікробіології і вірусології НАН України (реєстраційний номер 1MB В-7085), а одержану при культивуванні біомасу клітин піддають ферментативному гідролізу почергово розчином лізоциму концентрацією 0,4-0,6% і розчином трипсину концентрацією 0,4-0,6% при оптимальних для цих ферментів умовах. Спільними з прототипом ознаками є: - використання мікроорганізму Lactobacillus bulgaricus; - культивування в анаеробних умовах; - висушування біологічно активної речовини. Відмінними ознаками є: - використання в якості вихідної культури нового штаму Lactobacillus delbrueckii sp. bulgaricus 9702; - обробка одержаної в результаті культивування біомаси розчином лізоциму концентрацією 0,4-0,6% і розчином трипсину концентрацією 0,4-0,6% при оптимальних для цих ферментів умовах. Для реалізації способу використовують новий штам Lactobacillus delbrueckii sp. bulgaricus 9702, виділений із асоціативної культури молочнокислих бактерій. Штам депонований в колекції Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України як Lactobacillus delbrueckii sp. bulgaricus 1MB В-7085. Дата депонування 18.12.2002 p. Штам характеризується слідуючими властивостями: Морфологія клітин Грампозитивні, нерухомі, рівні палички 0,5х3-8мкм з заокругленими кінцями, розташовуються ланцюжками різної довжини. Фізіологічна характеристика штама. Факультативний анаероб, оптимальна температура (40±1)°С. Оптимум рН 6,0-6,2. Каталазонегативний, нітрати і нітрити не відновлює, желатину не розріджує, аміак із аргініну не утворює. Молоко згурджує, утворюючи кислоту (1,3%), молоко з лакмусом відновлює без утворення газу, відновлює молоко з метиленовою синькою, на середовищах з підвищеним вмістом (більше 4%) зористого натрію і рН більше 9,6 не росте. Не виживає після прогрівання при температурі 63°С протягом 30 хвилин, слиз не утворює, росте на середовищах з жовчю (40%). Зброджує: глюкозу, фруктозу, лактозу, сахарозу. Не зброджує: арабінозу, мальтозу, дульцит, ксилозу, рафінозу, інозит, рибозу, манніт, інулін, целобінозу, галактозу, ескулін, сорбозу, амігдалін, трегалозу, маннозу. Штам відноситься до групи delbrueckii роду Lactobacillus, ріст можливий від 28 до 50°С і рН від 3,5 до 8,5, оптимальна температура від 36 до 40°С, рН від 5,6 до 6,4. Культурально-морфологічні особливості штаму. Штам росте на середовищах, селективних для молочнокислих бактерій. На поверхні агаризованих середовищ утворює напівпрозорі, білуваті колонії, гладенькі з блиском, слабовипуклі, круглі з нерівним краєм діаметром 1-3мм. В товщі агару - білуваті дисковидні колонії діаметром 1-2мм. В рідкому середовищі утворює однородну муть і дрібнодисперсний осад. Спосіб, умови і склад середовищ для зберігання: На рідкому середовищі MRS з вмістом 0,5% глюкози і 2% крейди протягом 2-х місяців при температурі 4°С. Тривале зберігання в ліофілізованому стані при температурі (4-8)°С. Захисні середовища при висушуванні: сахароза - 10%, желатин - 1%, рН - 7,0±0,2 або сахароза - 10%, поліглюкін - 2%. Спосіб, умови і склад середовищ для розмноження штаму: Температура росту (39±1) °С, час 18-24 години, рН - 6,6-6,8. Середовище MRS; середовище Р-4 слідуючого складу, г/л: Рибний гідролізат -10,0; Дріжджовий екстракт - 10,0; Цукор -10,0; Магній сірчанокислий 7-водний - 0,2; Марганець сірчанокислий 5водний - 0,005; Натрій лимоннокислий - 5,0. Умови і склад середовищ для ферментації: Температура росту (39 ±1) °С, рН - 6,6-6,8. Середовище В-1 з вмістом амінного азоту слідуючого складу, %: Ферментолізат казеїну - 50% по амінному азоту; Ферментолізат соєвого борошна - 23% по амінному азоту; Дріжджовий екстракт - 17% по амінному азоту; Кукурудзяний екстракт - 10% по амінному азоту; Цукор - 0,5-1,5; Магній сірчанокислий 7-водний - 0,2; Марганець сірчанокислий 5-водний - 0,005; Калій фосфорнокислий двозаміщеіїий - 2,0; Вода дистильована - до 1 літра. Активність культури: накопичення біомаси 1-108 кл/мл. Титр визначають методом граничних розведень в стовпчиках агаризованого середовища MRS. Вирішення поставленої задачі обумовлене сукупністю властивостей нового штама-продуцента і запропонованим способом лізісу біомаси клітин ферментами лізоцимом і трипсином в названій послідовності і певній концентрації. Саме ця сукупність ознак забезпечує одержання біологічно активної речовини з широким спектром фармакологічної дії. Культивування штаму здійснюють в анаеробних умовах при температурі (39±1)°С на збалансованому поживному середовищі, яке містить: Калій фосфорнокислий однозаміщений -0,18-0,22 Магній сірчанокислий 7водний -0,01-0,03 Марганець сірчанокислий 5водний -0,005-0,007 Цукор-пісок -0,5-1,5 Ферментолізат казеїну -1,8-2,2 Ферментолізат борошна соєвого -0,8-1,2 Екстракт дріжджовий -1,8-2,4 Екстракт кукурудзяний -0,3-0,6 Після культивування протягом 14-24 годин проводять відокремлення біомаси клітин сепаруванням. Одержану біомасу змішують зі стерильною очищеною водою в співвідношенні 1:10 для промивки біомаси. Одержану суспензію сепарують для відокремлення біомаси. Промиту біомасу подають на сублімаційну сушарку для одержання сухої біомаси. Одержана суха біомаса повинна мати слідуючі показники: - порошок від світло-бежевого до світло-коричневого кольору; - масова частка вологи не більше 5%; - загальна кількість мікроорганізмів, не більше 1-103кол/г; - нешкідливість - 10мг/1 мишу; - наявність бактерій групи кишкової палички не допускається; - вміст глюкозаміну не менше 1,0%; - кількість життєздатних клітин не менше 1-105кол/г; Далі проводять ферментативний гідроліз сухої біомаси. Для чого одержану біомасу суспендують в стерильній очищеній воді, доводять рН суспензії до значення (7,0±0,1) 20% розчином натрію гідроокису. До суспензії біомаси приливають 0,5% розчин лізоциму в кількості 0,4-0,6% до вихідної біомаси. Для виключення бактеріального забруднення додають хлороформ. Гідроліз проводять при температурі (38±1)°С, перемішуванні з числом обертів мішалки 60 хв-1 протягом 8-10 годин. В процесі гідролізу щогодинно корегують рН суспензії до значення (6,9=0,2) 20% розчином натрію гідроокису. Контроль лізису проводять по змінюванню оптичної густини суспензії. Вимірювання оптичної густини проводять на фотоколориметрі КФК при довжині хвилі 540нм в кюветах товщиною 0,5см. Розведення вихідної суспензії підбирають таким чином, щоб значення оптичної густини ОГ540 складало 0,4-0,6 од. ОГ. Замір оптичної густини проводять через годину. Після проходження 7 годин гідролізу, ступінь гідролізу К розраховують по формулі: ОГ вих - ОГ кін К= ОД вих При К = 0,55-0,60 лізис клітин пройшов практично повністю. У випадку, якщо К менше вказаного значення, процес проводять протягом однієї години і повторюють вимірювання. Після закінчення лізису біомаси лізоцимом встановлюють рН суспензії (8,0±0,1), добавляючи невеликими порціями 20% розчин натрію гідроокису і доливають 1,0% розчин трипсину концентрацією 0,4-0,6% до вихідної біомаси. Процес гідролізу з трипсином проводять на протязі 8-10 годин, щогодинно корегуючи рН до значення (7,9±0,2) 20% розчином натрію гідрокису. Контроль закінчення процесу гідролізу трипсином здійснюють спектрофотометричне. Через 8 годин з інтервалом в 30 хвилин відбирають проби суспензії об'ємом 5,0мл, проби центрифугують при 10 000хв-1, підбираючи розведення розчину таким чином, щоб величина ОГ складала 0,4-0,6од, при довжині хвилі 280нм вимірюють оптичну густину. Процес обробки клітинного матеріалу трипсином вважається закінченим, якщо значення ОГ проб не відрізняються більше, ніж на 10%. У випадку, якщо різниця ОГ проб, взятих послідовно через 30хв., складає більше 10%, процес продовжують протягом однієї години і повторюють вимірювання. По закінченню лізису доводять рН до значення (7,0±0,2) 14%-ним розчином соляної кислоти. Далі проводять відокремлення продуктів ферментативного гідролізу на ультрафільтраційній установці. Концентрат після ультрафільтраційної установки подають на центрифугування (n = 18000 хв-1). Одержаний осад збирають в ємкість і передають на стадію знешкодження відходів. Одержаний ультрафільтрат разом з супернатантом від центрифуги подають на стерилізуючу фільтрацію на мембранній установці. Стерильний фільтрат передають на установку сублімаційної сушарки. Сушку ведуть при заданому режимі. Одержаний препарат фасують по 100г або 1000г в подвійні пакети із поліетиленової плівки і запаюють. Одержана біологічно активна речовина (субстанція) зберігає активність протягом двох років. Відокремлення і очистку продуктів ферментативного гідролізу можна проводити і іншими відомими способами. Одержана біологічно активна речовина (субстанція екстрабіол) являє собою: - порошок світло-коричневого кольору зі слабким специфічним запахом; - помірно розчинна у воді; - білок відсутній; - вміст золи не більше 20%; - рН 1% водного розчину від 6,5 до 7,5; - масова частка вологи не більше 7%; - не має антимікробної дії; - загальна кількість мікроорганізмів не більше 1-103кол/г, дріжджових і пліснявих грибів (сумарно) не більше 100кол/г; - вміст глюкозаміну не менше 2%; - вміст нуклеїнових кислот не менше 2%; - вміст пептидів не менше 40%. Такий біохімічний склад забезпечує заданий спектр фармакологічної дії (гастроентерологічної і гепатопротекторної властивості), підтвердженої експериментами по перевірці властивостей субстанції. За даними звітів 2 МОЛГМІ ім. M.I. Пирогова (м. Москва), препарат, одержаний по описаній вище технології, не кумулюється, не токсичний в межах дозувань, що перевищують терапевтичну дозу в 10 разів, відсутня токсична дія на репродуктивну систему. Препарат вводили внутрішньочеревне, підшкірне, перорально в широкому діапазоні концентрацій від 0,02 до 1500мг/кг ваги експериментальної тварини. При цьому виявлено, що субстанція не має алергенних властивостей, проявляє тенденцію до імуностимулюючої дії (посилюється гуморальна імунна відповідь), не викликає подразнюючої дії на слизову оболонку шлунково-кишково тракту. Дослідження специфічної активності субстанції показали найбільш сильну дію на репаративні процеси, значно скорочуючи строки загоювання виразок дванадцятипалої кишки. Субстанція має помірно виражену спазмолітичну і антацидну дію. За даними інституту проблем онкології ім. Р.Є. Кавецького ПАН України встановлена ЛД50 в 5000мг/кг маси тварини, що свідчить про нетоксичність терапевтичних доз з високою глибиною запасу. Дослідженнями ДНЦЛЗ (Україна, м. Харків) встановлено, що одержана субстанція проявляє виражену гепатопротекторну дію яка проявляється в результаті відновлення синтетичної, детоксицируючої і екскреторної функції печінки. В експериментах на тваринах використовували, як одержану субстанцію, так і її лікарські форми (препарати гастроентерологічної і гепатопротекторної дії, пігулки). Виявлені при дослідженні субстанції закономірності підтвердились і при використанні готової лікарської форми препаратів. При розробці ефективних доз і схем введення був вибраний оптимальний варіант, який дозволив підготувати інструкцію по клінічному вивченню препаратів. Одночасно з врахуванням ефективних доз і схеми введення проведений комплекс досліджень по хронічній токсичності і показана нешкідливість субстанції і її лікарських форм (в обсязі вимог ФК України) Українським науково-дослідним інститутом фармакології і токсикології (УНДІФТ). Промислове застосування способу показано в нижче наведених прикладах. Приклад 1. Вирощування культури Lactobacillus delbrueckii sp. bulgaricus 9702 здійснювали в досліднопромислових умовах в ферментаторі ємкістю 10м3 з інокулятором ємкістю 1,2м3 на середовищі слідуючого складу, %: Калій фосфорнокислий однозаміщений - 0,2 Магній сірчанокислий 7-водний - 0,02 Марганець сірчанокислий 5водний - 0,006 Цукор-пісок - 0,8 Ферментолізат казеїну - 2,0 Ферментолізат борошна соєвого - 1,0 Екстракт дріжджовий - 2,2 Екстракт кукурудзяний - 0,5 Ферментолізати і екстракт дріжджовий використовували готові, в сухому вигляді, для економії часу, енерговитрат і з метою одержання стабільних результатів. Змішували всі компоненти поживного середовища, стерилізували в ферментаторі при температурі (126-128)°С 40хв. Після охолодження середовища до 40°С проводили засів інокулятора однодобовою посівною культурою, вирощеною на середовищі MRS (8-10)л. Культивування проводять в анаеробних умовах при температурі (39±1)°С. Корегування рН в процесі росту культури не проводять. Через 6-10 годин інокулят в асептичних умовах пересівають в підготовлене поживне середовище в ферментатор (5,0м3 поживного середовища). Ріст культури супроводжується закисанням поживного середовища до рН 3,8-4,2, накопичення біомаси контролюють під мікроскопом і шляхом вимірювання оптичної густини культуральної рідини. Через 14-16 годин при стабілізації росту культури процес культивування припиняють шляхом охолодження культуральної рідини оборотною водою до температури (15-18)°С. Потім проводять сепарування біомаси на сепараторі Westfalia (швидкість подачі 250-300л/год). Після закінчення сепарації біомасу клітин (24кг) за допомогою спеціального пристрою виймають із сепаратора. Суспендують в 240л очищеної води і повторно сепарують. Промиту вологу біомасу (19,2кг) передають на сублімаційну сушарку. Вихід біомаси після сушки - 4,0кг (W = 8%). Беруть 250г сухої біомаси, добавляють 4,5л стерильної очищеної води, перемішують суспензію до гомогенного стану 30-40хв., корегують рН до значення (7,0±0,1) 20%-ним розчином натрію гідроокису. До суспензії біомаси добавляють розчин лізоциму (1г лізоциму розчиняють в 200мл стерильної води). Для виключення бактеріального забруднення доливають 30мл хлороформу. Нагрівають суміш до температури 38°С, число обертів мішалки встановлюють на позначку 60хв-1 і при даних параметрах проводять гідроліз протягом 8-10 годин, контролюючи рН і температуру. Час закінчення гідролізу визначають по зміні оптичної густини ( l = 540нм). При ступені гідролізу (К), рівному 0,55, лізис проведений повністю. Після закінчення гідролізу лізоцимом встановлюють рН суспензії (8,0±0,1) 20%-ним розчином натрію гідроокису і доливають розчин трипсину (1г трипсину розчиняють в 100мл стерильної води). Процес гідролізу трипсином проводять протягом 7-10 годин, контролюючи рН. Час закінчення гідролізу також визначають по зміні оптичної густини ( l = 280 нм). Час закінчення гідролізу визначають по різниці оптичних густин проб, взятих послідовно через 30 хвилин. При різниці оптичних густин менше 10% процес закінчують. Далі доводять рН суспензії до (7,0±0,2) 14%-ним розчином соляної кислоти і передають одержаний лізат на ультрафільтрацію. Ультрафільтрацію проводять на установці УМТ-Л при температурі менше 40°С. Фільтрат збирають в бутель. Концентрат центрифугують при 18000 хв-1 протягом 40 хвилин, супернатант збирають в ємкість і вливають в бутель з фільтратом, а одержаний осад передають на знешкодження. Далі фільтрат передають на стерилізуючу фільтрацію на мембранну установку Владипор типу МФА-А. Стерильний фільтрат висушують на сублімаційній сушарці ТГ-50 при температурі мінус 35°С протягом 38 годин. Висушену субстанцію фасують в подвійні мішки із поліетиленової плівки по 100-1000г. Вихід субстанції з порції склав 140г з вологістю 5%, або 56% від вихідної сухої біомаси (9,4% від вологої біомаси) (або 2,0 кг субстанції з однієї операції ферментації об'ємом культуральної рідини (к.р.) 5,5м3). Субстанція - порошок світло-коричневого кольору помірно розчиннний у воді. Вологість - 5%. Має стабільний склад (глюкозаміни не менше 2%, нуклеїнові кислоти не менше 2%, пептиди не менше 40%) і біологічну активність по підсиленню фагоцитозу не менше 30%. Субстанція зберігає активність на протязі 2 років. Приклад 2. Біомасу клітин штаму Lactobacillus delbrueckii sp. bulgaricus 9702 одержували так само, як в прикладі 1, але при обробці ферментами використовували розчин лізоциму і розчин трипсину в кількості 0,6% по відношенню до вихідної біомаси. Останні операції проводили аналогічно прикладу 1. При цьому було одержано 135г субстанції з вологістю 5% або 54% від вихідної сухої біомаси (7,7% від вологої біомаси або 1,92кг субстанції з однієї операції ферментації з об'ємом к.р. 5,5м3). Вихід БАР в технологічному циклі склав 5400 лікарських доз гастроентерологічної властивості і 67000 доз гепатопротекторної властивості, що практично однаково з прикладом 1. Властивості одержаної субстанції аналогічні одержаній в прикладі 1. Приклад 3. Біомасу штаму Lactobacillus delbrueckii sp. bulgaricus 9702 одержували способом, описаним в прикладі 1, а обробку біомаси розчинами лізоциму і трипсину проводили в кількості 0,8% по відношенню до вихідної біомаси. Процес лізісу при цьому пройшов за 2-3 години, одержано субстанції 120г. По якісним показникам препарат відповідав вимогам НТД, тільки по вмісту нуклеїнових кислот (їх було 1,8%) препарат одержаний некондиційний. Таким чином, при використанні для стадії ферментативного гідролізу лізоциму в концентрації 0,4-0,6% і трипсину в концентрації 0,4-0,6% до вихідної біомаси вдається одержати продукт з заданими виходом і якістю, які відповідають вимогам розробленої НТД.